Структурно-функциональная организация ферментов Леонор Михаэлис Мауде Леонора Ментен Берлин, 1912 г.

Структурно-функциональная организация ферментов Задача Получить уравнение для скорости ферментативной реакции, исходя из известных, доступных наблюдению параметров

Структурно-функциональная организация ферментов Начальная скорость

Структурно-функциональная организация ферментов Уравнение Михаэлиса-Ментен В чем его смысл? Позволяет получить формальные характеристики скорости ферментативной реакции вида Уравнение реакции превращения субстрата (S) в продукт (P), катализируемой ферментом (E); Уравнение Михаэлиса-Ментен описывает зависимость скорости реакции от концентрации субстрата и, в частности, демонстриует явление насыщения. Условия, при которых работает уравнение Михаэлиса-Ментен: 1)Стационарная фаза реакции, т.е. [ES]=const, d[ES]/dt=0; 2)Измеряется начальная скорость; [S] [S 0 ] 3)[E] = [E 0 ] – [ES] k1k1 k -1 k2k2 k -2

Структурно-функциональная организация ферментов Формальная ферментативная кинетика Скорость мономолекулярной реакции прямо пропорциональна концентрации вещества [A] Если ту же реакцию катализирует фермент, при определенной концентрации наблюдается насыщение. v [A] v

Структурно-функциональная организация ферментов Условие стационара При стационарной фазе реакции концентрация фермент-субстратного комплекса, [ES], не меняется Престационарная фаза, при которой происходит накопление [ES] обычно очень короткая Уравнение Михаэлиса-Ментен описывает скорость ферментаивной реакции только в стационарной фазе k1k1 k -1 k2k2 k -2

Структурно-функциональная организация ферментов Измеряется начальная скорость В начале реакции концентрация продукта, [P] очень мала. Так что количеством [ES], полученного из обратной реакции E+P, можно пренебречь. Иными словами, реакция ES -> E+P необратима Субстрат только начал расходоваться, [S] [S 0 ]. В этом случае уравнение приобретает вид: k -1 k1k1 K -1 k2k2 k1k1 k2k2 k -2

Структурно-функциональная организация ферментов Скорость реакции пропорциональна концентрациям реагентов Пригодилось наследие неферментативной кинетики: Скорость накопления фермент-субстратного комплекса, v f : Скорость обратной реакции (исчезновения ES) v d : В стационарной фазе [ES] не меняется: k1k1 k -1 k2k2

Структурно-функциональная организация ферментов Вывод уравнения Михаэлиса-Ментен Мы не можем узнать текущую концентрацию фермента, но знаем начальную [E o ], которая равна сумме концентраций комплекса [ES] и текущей концентрации свободного фермента, [E]: В стационарной фазе скорость концентрация [ES] постоянна: Скорость образования продукта v = k 2 [ES] :

Структурно-функциональная организация ферментов Некоторые следствия уравнения ММ Скорость образования продукта обычно можно наблюдать экспериментально. Максимальная скорость достигается при полном насыщении субстратом, когда [S] Переписываем уравнением ММ в виде: Скорость реакции уже не меняется

Структурно-функциональная организация ферментов Смысл K m K m выводится из констант скоростей K m в условиях Михаэлиса-Ментен определяет скорость распада фермент-субстратного комплекса при равновесии, Константа диссоциации Маленькая K m означает сильное связывание; высокая K m означает слабое связывание. K m равна концентрации субстрата, при которой скорость реакции равна половине максимальной v=1/2v max k1k1 k -1

Структурно-функциональная организация ферментов Смысл v max V max в реальности недостижима, поскольку требуется, чтобы все молекулы фермента были заняты субстратом (а как же химическое равновесие?) Число оборотов, k cat, Равно числу молекул субстрата, превращаемых в продукт одной молекулой фермента в единицу времени при условии насыщения фермента субстратом, [S]>>[Et], k1k1 k -1

Структурно-функциональная организация ферментов ФерментСкорость (c -1 ) Каталаза Ацетилхолинэстераза Лактат-дегидрогеназа Химотрипсин100 ДНК-полимераза I 15 Лизоцим0,5 V max (число оборотов) некоторых ферментов

Структурно-функциональная организация ферментов Порядок уравнения ММ Когда концентрация субстрата мала, уравнение ММ уравнение первого порядка по [S] При той же низкой концентрации субстрата, [E t ] [E], уравнение ММ второго порядка по [E] и [S], k cat /K m называют кажущейся константой второго порядка: Когда концентрация субстрата велика, уравнение ММ уравнение нулевого порядка по [S]:

Структурно-функциональная организация ферментов КПД ферментативного катализа, k cat /K m k cat /K m говорит о том, насколько «хорошо работает» фермент Верхний предел k cat /K m лимитируется скоростью диффузии E и S

Структурно-функциональная организация ферментов Графическое представление уравнения ММ можно изобразить так но это непрактично [S][S] v v max KmKm

Структурно-функциональная организация ферментов Линеаризация по Лайнуиверу и Берку (Lineweaver-Burk) Уравнение ММ приобретает вид y=kx+b для обратных координат: 1/[S] 1/v 1/v max -1/K m Угловой к-т=K m /v max График в двойных обратных координатах

Структурно-функциональная организация ферментов Картинка из жизни

Структурно-функциональная организация ферментов Картинка из хорошей жизни

Структурно-функциональная организация ферментов Линеаризация по Эди-Хофсти (Eadie-Hofstee) v/[S] v Угловой к-т=-K m v max

Структурно-функциональная организация ферментов Линеаризация по Хейнсу-Вольфу (Hanes-Wolff), они же Диксон и Уэбб [S][S] [S]/v K m /v max -K m Угловой к-т=1/v max Hanes-Wolff Plot

Структурно-функциональная организация ферментов Ингибирование ферментов Ингибиторы связываются с ферментами и уменьшают их активность. Бывают обратимыми и необратимыми; Обратимые ингибиторы связываются с ферментами посредством невалентных взаимодействий. Различают два вида обратимых ингибиторов –Конкурентные ингибиторы; –Неконкурентные ингибиторы; Необратимые ингибиторы ковалентно связываются с ферментами, уменьшая концентрацию активных ферментов.

Структурно-функциональная организация ферментов Обратимые ингибиторы субстрат конкурентный ингибитор неконкурентный ингибитор

Структурно-функциональная организация ферментов Влияние ингибиторов на уравнение ММ

Структурно-функциональная организация ферментов Конкурентные обратимые ингибиторы связывание только с E v [S][S] v max KmKm 1/[S] 1/v 1/v max -1/K m Угл. к-т=K m /v max k1k1 k -1 k2k2 k3k3 k -3 K m повышается v max не меняется +ингибитор K m (1+[I]/K I ) -1/(K m (1+[I]/K I )) Угл. к-т= K m (1+[I]/K I )/v max

Структурно-функциональная организация ферментов Неконкурентные обратимые ингибиторы Связывание с E и ES k1k1 k -1 k2k2 KIKI K m не меняется v max уменьшается KIKI +ингибитор 1/[S] 1/v 1/v max -1/K m Угл. к-т =K m /v max (1+[I]/K I )/V max Угл. к-т= K m (1+[I]/K I )/v max v [S][S] v max KmKm KmKm V max /(1+[I]/K I )

Структурно-функциональная организация ферментов Бесконкурентные обратимые ингибиторы Связывание только с ES k1k1 k -1 k2k2 K m уменьшается v max уменьшается K m /v max не изм +inhibitor KIKI 1/[S] 1/v 1/v max -1/K m Slope=K m /v max (1+ K I /[I])/V max Угл. к-т = K m /v max v [S][S] v max KmKm K m /(1+ K I /[I]) V max /(1+K I /[I]) - (1+ K I /[I])/K m

Структурно-функциональная организация ферментов Смешанный тип ингибирования +ингибитор 1/[S] 1/v 1/v max -1/K m Угл. к-т=K m /v max +ингибитор 1/[S] 1/v 1/v max -1/K m Угл. к-т =K m /v max