6. Многосубстратные ферментативные реакции. Физико-химические основы биокатализа в иллюстрациях 6. Многосубстратные ферментативные реакции. Уравнения, - презентация

1 6. Многосубстратные ферментативные реакции. Физико-химические основы биокатализа в иллюстрациях 6. Многосубстратные ферментативные реакции. Уравнения, описывающие эти реакции. Определение параметров в стационарном режиме. Порядок присоединения субстратов. Методы его определения

2 Простейший случай многосубстратной реакции – реакция с двумя субстратами 1.Последовательное связывание субстратов с образованием тройного комплекса:

3 Простейший случай многосубстратной реакции – реакция с двумя субстратами Двусубстратная Односубстратная реакция реакция реакция реакция S 1 >>S 2 Должен быть известен порядок присоединения субстратов

4 Простейший случай многосубстратной реакции – реакция с двумя субстратами Для схемы с последовательным связыванием субстратов уравнение скорости реакции: v=k 3 [ES 1 S 2 ] Для нахождения [ES 1 S 2 ] в систему уравнений добавляется уравнение материального баланса и условия квазистационарности: E 0 = [E] + [ES 1 ] + [ES 1 S 2 ]

5 Простейший случай многосубстратной реакции – реакция с двумя субстратами D E = k -1 k -2 +k 2 S 2 k 3 +k -1 k 3 ; ; D ES 1 = k 1 S 1 k 3 +k 1 S 1 k -2 D ES 1 S 2 = k 1 S 1 k 2 S 2

6 v = = Для определения параметров реакции из экспериментальных данных это уравнение можно линеаризовать : =

7 Определение величин коэффициентов φ i Накопление продукта реакции во времени при различных концентрациях S 1 и S 2 =const, или наоборот, при различных концентрациях S 2 и S 1 =const.

8 Определение величин коэффициентов φ i a=φ 0 +φ 2 /S 2 b=φ 1 +φ 12 /S 2

9 Простейший случай многосубстратной реакции – реакция с двумя субстратами 2.Произвольный порядок присоединения двух субстратов в процессе образования тройного комплекса: v = где D ES 1 S 2 – определитель узла графа, в котором происходит образование продуктов реакции.

10 Порядок присоединения субстратов От определения порядка присоединения субстратов зависит, какой схемой реакций будет описываться образование продукта и как будут рассчитываться параметры реакции.

11 Методы определения порядка присоединения субстратов Гель-фильтрацияГель-фильтрация. Метод задержки в гелеМетод задержки в геле (gel retardation, или electrophoretic mobility shift assay – EMSA). Тушение флуоресценцииТушение флуоресценции. Можно следить за изменением интенсивности флуоресценции остатков триптофана (Trp) в белковой молекуле фермента, происходящим при комплексообразовании. Интенсивность флуоресценции при образовании комплекса с ферментом может изменяться и для субстрата. В этом случае можно использовать аналог субстрата, имеющий флуоресцентную метку.

12 Использование аналогов субстратов для определения порядка присоединения субстратов Аналоги субстратов выбираются таким образом, чтобы они продолжали быть субстратами, то есть участвовали в каталитических стадиях ферментативного процесса.Аналоги субстратов выбираются таким образом, чтобы они продолжали быть субстратами, то есть участвовали в каталитических стадиях ферментативного процесса. В случае аналога субстрата кинетические характеристики ферментативной реакции (K M, k cat ) могут измениться для тех стадий, в которых принимает участие данный субстрат (его аналоги).В случае аналога субстрата кинетические характеристики ферментативной реакции (K M, k cat ) могут измениться для тех стадий, в которых принимает участие данный субстрат (его аналоги).

13 Определение порядка присоединения субстратов Для исследования порядка присоединения субстратов в реакции аминоацилирования, катализируемой аминоацил-тРНК-синтетазами, были использованы фторированные аналоги аминокислот, например: Фенилаланин Парафтор-фенилаланин

14 Метод конкурентных ингибиторов Реакция аминоацилирования тРНК с образованием фенилаланил-тРНК, катализируемая фенилаланил-тРНК- синтетазой): E + АТР + Phe Е · [Phe~АМР] + рр i Е · [Phe~АМР] + тРНК Phe Е + Phe~тРНК Phe + АМР

15 Метод конкурентных ингибиторов Аминогруппа – при ее замене сродство субстрата к ферменту резко падаетАминогруппа – при ее замене сродство субстрата к ферменту резко падает Фенильная группа участвует в узнавании субстрата.Фенильная группа участвует в узнавании субстрата. Фенилаланинол (Phe-ol) – конкурентный ингибитор фенилаланина в реакции аминоацилирования.Фенилаланинол (Phe-ol) – конкурентный ингибитор фенилаланина в реакции аминоацилирования. Kd (Phe)=10 -6 M Kd (Phe-ol)=10 -5 M Фенилаланин Фенилаланинол

16 Метод конкурентных ингибиторов 1.Ингибитор образует комплекс с ферментом 2. Ингибитор образует тройной комплекс ES 1 I Для установления порядка присоединения субстратов нужно решить уравнения для схем 1 и 2, с помощью метода графов.

17 Показано экспериментально: чаще всего, в т.ч. в реакции аминоацилирования, первым субстратом является специализированный субстрат (кофермент-АТР), хотя комплекс фермента с коферментом ES 1 может быть менее прочным, чем комплекс фермента со вторым субстратом ЕS 2. При аминоацилировании тРНК Val на первом этапе происходит активация аминокислоты АТР: Е + АТР + Val ЕАМРVal + рр i Сначала в активном центре синтетазы от молекулы АТР отщепляются две фосфатные группы, образуя молекулу пирофосфата (ррi), и на их место становится аминокислота. Образованное соединение (аминоациладенилат) состоит из ковалентно связанных высокоэнергетической связью аминокислотного остатка и АМФ. Комплекс фермента с Val прочнее (K d =10 -6 M), чем комплекс с АТР (K d = M), но фермент при такой последовательности связывания дальнейшие реакции не катализирует.