Лекция 15 ДЕТЕРМИНАЦИЯ ПОЛА У ЖИВОТНЫХ

Первичные половые клетки (ППК) у млекопитающих, производные клеток внутренней массы, выявляются в пограничном районе желточного мешка и аллантоиса вблизи задней части кишки. Затем ППК мигирируют в гонадные валики

Маркёрными белками ППК млекопитающих являются фактор транскрипции Oct4 и щелочная фосфатаза

ППК дрозофилы обособляются в районе полярных гранул (на заднем конце зародыша) в ходе 9-го деления ядер

Потомство самок дрозофилы с мутацией gcl является стерильным

Миграция ППК дрозофилы из района полярной плазмы в районы латеральной мезодермы парасегментов, где образуются гонады. Слева обработка антителами (АТ) к Vasa (A-F)- специфический маркер ППК, а D – еще обработан и АТ к engrailed, чтобы обозначить сегменты. Справа - схематически представлен путь миграции ППК в теле зародыша. Белок энтодермы Wunen отталкивает ППК, а белок мезодермы Columbus – притягивает их в район сегментов, где образуются гонады

Миграция ППК у амфибий

Регуляция пола может осуществляться у животных различным образом благодаря генетическим факторам или (и) факторам внешней среды

Хромосомное определение пола. У животных существуют половые хромосомы, так что пол определяется в зависимости от числа и состава половых хромосом. Самки животных могут определяться генотипами XX, WZ. Самцы - генотипами XY, ZZ или X0. Примеры - XX- самки, XY- самцы - насекомые (дрозофилы), рыбы, пресмыкающиеся, млекопитающие XX-самки, X0-самцы (насекомые) водяной клоп Protenor, некоторые бабочки и круглые черви. WZ- самки, ZZ-самцы - некоторые виды бабочек, рыбы, земноводные, пресмыкающися, птицы XX- гермафродиты, X0 -самцы - нематоды (одновременно) XX, WZ -самки XY, ZZ - самцы - некоторые рыбы и некоторые пресмыкающиеся. Диплоидные особи – самки, гаплоидные – самцы (перепончатокрылые насекомые)

У рыб наряду с раздельнополыми видами есть и гермафродиты. Гермафродиты могут быть : 1. Синхронные (одновременно существуют яичник и семенник) - Servanus scriba: поочереди мечут икру и её оплодотворяют. 2. Асинхронные (гонады генетически запрограммированы на смену типа в ходе онтогенеза): рыба - попугай; Последние в свою очередь делятся на протогинные (сначала «самка») и протоандрические (сначала «самец») - Sparus auratus. Кроме того, выбор пола молодой особи может определяться соотношением полов в существующей популяции рыб (пример - рыбка коралловых рифов)

Изменения структуры гонад гермафродитной рыбы Sparus auratus

Наряду с генетическим факторами (наличие половых хромосом того или иного типа) на формирование пола у некоторых позвоночных ( рыб, земноводных и пресмыкающихся) и некоторых беспозвоночных оказывают влияние факторы внешней среды. У гермафродитных рыб выведение из икры самцов или самок может зависеть от различных факторов, в числе которых: pH среды, наличие питательных веществ, температура и др. У рептилий - температура инкубации яиц (черепахи, крокодилы, аллигаторы, некоторые ящерицы (гекконы).

Корреляция между сотношением полов F/ (F+M) и температурой у рыбы Menidia menidia появляется и нарастает в более теплых водах ареала обитания.F-female (самка), M-male (самец)

Зависящее от температуры (инкубации яиц) определение пола у трех представителей класса пресмыкающихся: грифовая (Macroclemis) и красноухая (Trachemys) черепахи и аллигатор.

Температуро-зависимая детерминация пола у ящериц, черепах и крокодилов

Виды гормонов мужских и женских половых желез млекопитающих

Синтез стероидных половых гормонов у позвоночных

Факторы внешней среды, определяющие формирование пола у позвоночных (пресмыкающихся), могут действовать, через изменение баланса половых гормонов. Мужские половые гормоны - андрогены (тестостерон и ряд других) Женские половые гормоны - эстрогены. Показано что фермент P450 ароматаза, катализирующий превращение тестостерона в эстроген, у пресмыкающихся способен менять свою активность в зависимости от температуры окружающей среды. Температура инкубации яиц в последнюю треть развития пресмыкающихся (черепах, крокодилов, аллигаторов) является определяющей для формирования пола выводящихся из яиц животных.

Пути биосинтеза мужских и женских стероидных гормонов у позвоночных (на примере млекопитающих)

У эхиуриды Bonellia (организма, обитающего на морском каменистом грунте) формирование пола происходит у личинки в зависимости от места её прикрепления к поддерживающей среде. При осаждении на скалистый грунт формируется самка (тело - 10 см, ротовой хоботок -proboscis -около метра), при осаждении на proboscis самки - формируется самец (1-3 мм длиной), который мигрирует по кишечнику и обитает в матке (или нефридии), оплодотворяя яйца.

У улитки- блюдечка Crepidula fornicata, новая особь, располагающаяся в колонии сверху - всегда самец. Затем мужская половая система дегенерирует и самец превращается в самку

Детерминация пола у млекопитающих определяется генотипом (половыми хромосомами): ХХ и XY

Первичная и вторичная детерминация пола у млекопитающих Первичная детерминация пола – это детерминация гонад. Семенники и яичники формируются из бипотенциальных гонад в зависимости от полового генотипа XY или XX. При наличии Y- хромосомы, в независимости от числа X-хромосом, пол гонады мужской Вторичная детерминация пола - определяет фенотип особи вне гонад. Она затрагивает системы выводящих канальцев и протоков самцов и самок, формы их гениталий. Вторичные половые признаки контролируются гормонами, секретируемыми половыми железами. Удаление гонад приводит к формированию женского фенотипа безотносительно к половому генотипу.

Дифференцировка бипотенциальных гонад и образование половых структур из Вольфова и Мюллерова протоков

Дифференцировка гонад человека (начало)

Дифференцировка гонад человека (продолжение)

Дифференцировка гонад человека (окончание)

При анализе Y-хромосомы выяснилось, что гипотетический фактор, отвечающий за формирование пола, существует в действительности- это ген SRY/Sry (sex region of Y-chromosome), локализован на коротком плече Y-хромосомы. Его белок - транскрипционный фактор, он содержит HMG-домен и относится к семейству SOX-белков. На X-хромосоме гена SRY нет. Ген был найден также в редких случаях у лиц мужского пола с генотипом XX, которые содержали транслоцированный ген SRY. Для детерминации мужского фенотипа нужен также белок другого гена Sox-семейства - SOX9, локализованного на аутосоме. Мутация по нему вызывает превращение особей XY в самок или в гермафродитов. Гены SRY и SOX9 экспрессируются вместе в гонадных валиках самцов

Мышь с половым генотипом XX, трансгенная по гену SRY(справа), в норме локализованным на Y-хромосоме обладает фенотипом самца

Проникновение (миграция) мезонефротических клеток (любого генотипа: XY или XX) в Sry+ гонадные валики (генотипа XY) in vitro, доказывает важность экспрессии гена Sry в клетках производных гонадных валиков для индукции ими образования связи Вольфова протока (через мезонефротические клетки) с половыми тяжами (будущими семенными канальцами), формирующимися из гонадных валиков

Экспрессия гена Sry приводит к активации генов SF1 и Sox9 в тех же клетках. Взаимодействие белков Sox9 и SF1(стероидогенного фактора) важно для активации гена антимюллерова гормона (Amh) в клетках Сертоли, вызывающего дегенерацию мюллерова протока.Эти же факторы транскрипции в клетках Лейдига стимулируют образование и секрецию тестостерона.

Роль антимюллерова гормона в дегенерации мюллерова протока (плод крысы). Слева - открыты оба протока, справа -через 3 суток после действия AMH, открыт только вольфов проток

Выявление гена DAX1 на X-хромосоме, ответственного за формирование женского пола. Ген был идентифицирован на X- хромосоме (в виде двух копий) при анализе двух близнецов с женским фенотипом, но с генотипом XY

Тестостерон и 5 -дигидротестостерон - андрогены. Тестостерон синтезируется в клетках Лейдига и отвечает за образование эпидидимиса, семенных пузырьков, vas diferens и, в меньшей степени, за образование мошонки и пениса. Дигидротестостерон образуется из тестостерона (фермент- 5 кетостероидредуктаза), синтезируется позднее в мочеполовом синусе и в семенных пузырьках, более активен в индукции образования уретры, простаты, мошонки и пениса. Небольшая община в Доминиканской республике имеет членов, несущих мутацию по ферменту кетостероидредуктазе, и, следовательно, не содержащих дигидротестостерона. Эти люди с генотипом XY до полового созревания имеют неразвитые внешние женские признаки, но при половом созревании большие количества тестостерона все же стимулируют образование мошонки и пениса и эти люди идентифицируются как юноши. В клетках Лейдига, кроме тестостерона, синтезируется (и секретируется из клеток) инсулин-подобный гормон 3 - (Insl-3). Он вносит вклад в формирование мошонки

Районы мужской половой системы, формирующиеся под контролем тестостерона и дидротестостерона.

Мужские и женские стероидные гормоны. Эстрогены (включая их аналоги- диэтилстилбестрол и др. ) важны не только для формирования женских половых органов -матки, шейки матки, влагалища и клитора -из структур мюллерова протока, но также для развития молочных желез. Диэтилстилбестрол важен для нормального протекания беременности. У самцов эстрогены продуцируется в ряде тканей (включая мозг) и важны для фертильности спермы. Если концентрация эстрогенов в крови выше у самок, то концентрация их в канальцах семенников - rete testis выше, чем в крови у самок. У самок также имеются андрогены

Виды женских половых гормонов и их функции

Детерминация пола у дрозофилы

Хромосомная детерминация пола у Drosophila Особи генотипа XX -самки и генотипа XY -самцы. В случае генотипа X0 -также образуются самцы, но стерильные У дрозофилы (и у многих других насекомых) нет гормонального контроля формообразования пола. Пол определяется соотношением числа X-хромосом к числу наборов аутосом - X:A. В случае X:A =1 -пол женский, в случае X:A = 0, 5 -пол мужской.. Балансовая гипотеза определения пола К. Бриджеса.

Гинандроморфы дрозофилы и мотылька, образовавшиеся в результате утраты в раннем развитии из ряда клеток одной их X-хромосом. В результате организм содержит частично женские, частично мужские структуры.

Гены нумераторы (числителя), локализованные на X-хромосоме, кодируют факторы транскрипции sisterless-a, sisterless-b=scute (sis- a,sis-b), runt (runt), активирующие транскрипцию гена sex-lethal (sxl) с проксимального промотора. Гены деноминаторы (знаменателя), локализованные на аутосомах, кодируют факторы транскрипции deadpan (dpn), daughterless (da), extramacrohaeta (emc) и др., которые репрессируют активацию гена sex-lethal (sxl) с проксимального промотора. Активаторы (белки-нумераторы) и репрессоры (белки- деноминаторы) способны комплексировать и решающим событием в активации sxl является преодоление возможности репрессоров угнетать действие активаторов. В случае активации sxl c раннего (ближнего) промотора (при отношении X:A=1) (генотип -XX) альтернативный сплайсинг осуществляется с образованием функционально активного белкового продукта sxl, который, являясь фактором сплайсинга, взаимодействует с собственной пре-иРНКи закрепляет этот же вариант сплайсинга sxl для дальнейших целей. В случае отношения X:A=0,5 (генотип XY/X0) в транскрипционном комплексе преобладают репрессоры, sxl не транскрибируется с раннего (проксимального) промотора.

Схематическое представление генетической программы детерминации пола Drosophila, определяемое соотношением X:A. Детерминация пола по мужскому или женскому типу определяется по цепочке генов: sex-lethal, transformer, doublesex последовательной регуляцией альтернативного сплайсинга транскриптов. Формирующийся в конечном счёте фактор транскрипции Doublesex существует, таким образом, в виде двух вариантов - Dsx F (самки) и Dsx M (самца), что и определяет будущий пол.

Каскады регуляций, контролирующих формирование половых структур самки и самца дрозофилы Различная активация гена sxl (sex-lethal) будущих самок и самцов дрозофилы. Деятельность генов нумераторов и деноминаторов определяет альтернативные транскрипцию и сплайсинг sxl.

Различная активация гена sxl будущих самок и самцов дрозофилы. Деятельность генов нумераторов и деноминаторов определяет альтернативные транскрипцию и сплайсинг sxl

Альтернативный сплайсинг -основной путь реализации программы детерминации пола у дрозофилы (последовательность событий)

По ходу развития, когда sxl начинает транскрибироваться с позднего (дистального) промотора, альтернативный сплайсинг sxl при генотипе XY/X0 идет с сохранением третьего экзона, в котором находится стоп-кодон. В результате чего белковый продукт sxl у самца - дефектен. Он не способен функционировать как фактор сплайсинга. Напротив, белковый продукт sxl самки (XX)-функционально активный фактор сплайсинга не только для своей РНК, но и для пре- иРНК гена transformer (tra), что предопрделяет образование белка tra как следующего фактора сплайсинга, модифицирующего (совместно с другим белком- tra2) сплайсинг следующего в каскаде гена – doublesex (dsx). В результате образуется фактор транскрипции -Dsx F (фенотипа самки). В отсутствии активного tra-белка сплайсинг dsx проходит по другому варианту и образуется видоизмененный фактор транскрипции Dsx M (фенотипа самца).

Формирование мужской и женской половых гонад у дрозофилы под контролем различных форм фактора транскрипции Dsx

Роли Dsx M и Dsx F в формировании пола у дрозофилы. Dsx- транскрипционный фактор, действующий как репрессор или как активатор, для каждого пола в альтернативной манере

Нематода Caenorhabditis elegans имеет два пола: XX -гермафродиты (более 99% популяции) и X0 -самцы. У взрослой особи (гермафродита) число соматических клеток тела- 959 (у первой личинки -558). Число половых клеток больше (более 1500). В случае самооплодотворения 0,2% новых особей -самцы, остальные - гермафродиты, в случае спаривания особей XX и X0 - половина новых особей - самцы.

Нематода Сaenorhabditis elegans, гермафродитная особь

Нематода Сaenorhabditis elegans, самец

Детерминация пола у С. elegans (также как и у Drosophila имеет значение отношение числа X-хромосом к числу наборов аутосом; Sex-1 –один из представителей генов- нумераторов). Определяющими моментами являются активация гена tra-1 (не родственного гену tra дрозофилы). Соотношение X : A сканируется фактором транскрипции Sex-1, влияющим на активность гена xol-1: высокие дозы белка xol-1 меняют характер регуляции в детерминации пола с активации tra-1 (гермафродиты) на репрессию tra-1 (самцы)

Сигнальная цепочка детерминации пола C. elegans. Перемещение в ядро транскрипционного фактора TRA-1 означает реализацию гермафродитного фенотипа. Фактор Her-1 особи X0, взаимодействуя с мембрано-связанным белком TRA-2, вызывает детерминацию пола по мужскому типу. При этом промежуточный участник – белок FEM, удерживает TRA-1 в цитоплазме (диссоциирует с последним при детерминации пола по XX-гермафродитному пути).

Детерминация первичных половых клеток у гермафородитов по мужскому или женскому пути осуществляется в два этапа: 1этап -переход от митоза к мейозу контролируется дистальной концевой клеткой гонады и сигналингом Notch/Delta.Ген glp1 первичных половых клеток - гомолог гена Notch дрозофилы, ген lag2 клетки дистального конца гонады - гомолог Delta, его белковый продукт входит в состав плазматической мембраны дистальной клетки

Детерминация первичных половых клеток по мужскому или женскому пути у гермафордитов осуществляется в два этапа (митоз и мейоз): 2 этап (мейоз) -выбор между сперматогенезом и оогенезом - контролируется на уровне трансляции иРНК fem3 белками Nanos и Pumilio (гомологами одноименных белков дрозофилы). Одновременное присутствие Pumilio и Nanos блокирует трансляцию иРНКfem3 и, как следствие, осуществляется оогенез.

Образование градиента Hunchback в бластодерме дрозофилы. Контроль трансляции мРНК hunchback белками Nanos и Pumilio

Эволюционные связи между генами, ответственными за детерминацию пола у разных животных В то время как Sry обнаруживается только у млекопитающих, Sox9 имеется у всех позвоночных. Следовательно, Sox9 является более древним геном и, видимо, играет более общую роль в детерминации пола, чем Sry. Умлекопитающих Sox9 активируется родственным геном Sry. Таким образом, Sry может действовать, прежде всего, как «включатель»,активирующий ген Sox9, а уже белок Sox9 инициирует эволюционно консервативный путь образования семенников (Pask, Graves 1999).

Сколько раз в эволюции возникали механизмы детерминации пола? Гипотеза: Cуществуют две группы позвоночных (начиная с костистых рыб), у одной группы –функционально активен ортолог гена Sox9, у другой гены ортологи DMRT

На 9-й хромосоме человека (короткое плечо) было идентифицировано 3 гена Dmrt (1-3), родственные генам Dsx (дрозофилы) и Mab3 (С. elegans). Эти гены (особенно Dmrt1) важны для формирования семенников. Делеция участка 9-й хромосомы, содержащей гены Dmrt ведет к реверсии пола, как и делеция Sox9 (на 17-й хромосоме).

Ортологи генов Sox 9 активно экспрессируются в клетках Сертоли у птиц и пресмыкающихся (ящерицы). Семейство Sox-генов идентифицировано в геноме рыбы Medaka. Экспрессирующийся ортолог гена Dmrt 1 был найден в семенниках птиц, пресмыкающихся (аллигаторы, черепахи) и некоторых рыб (Medaka, puffer fish), но не найден у других (zebrafish, telyapia).

Хотя млекопитающие, дрозофила и C. elegans имеют различные механизмы детерминации пола (основанные на различных способах передачи сигналов по цепочке), все они содержат гены семейства DM, экспрессия которых связана с формированием фенотипа самца. Dsx дрозофилы – необычный представитель семейства генов DM, поскольку его белковый продукт (в виде изоформы Dsx F ) также важен для формирования фенотипа самки.

Возможное участие гена DMRT в формировании семенников и сперматогенезе

Возможность существования консервативных факторов детерминации пола у разных животных