Разработка новых препаратов для фотодинамической терапии ран, ожогов и трофических язв на основе наноразмерных комплексов амфифильных полимеров с порфириновыми фотосенсибилизаторами Участники работы: ИХФ РАНМГУ проф. А.Б. Соловьева дхн Н.С. Мелик-Нубаров кхн Н.Н. Глаголев студент Т.М.Жиентаев кхн Т.С. Зархина кхн А.А. Рахнянская кхн В.А.Тимофеева нс Н.А. Аксенова РОНЦ им.Н.Н.Блохина Центр лазерной медициныдф-мн А.В. Иванов проф. П.И.Толстых дф-мн А.А. Штиль

ПФС вводится внутривенно, либо применяется наружно в виде геля. Затем прводят облучение пораженной области видимым светом. ПФС переходит в возбужденное состояние, активирует молекулярный кислород … …который пазрушает больные клетки. Принципиальная схема фотодинамической терапии Метод ФДТ, разработанный в 60-годы прошлого века для лечения злокачественных опухолей, основан на селективном воздействии лазерного излучения на предварительно обработанные фотосенсибилизатором (ФС) больные ткани. В медицинской практике сейчас используются порфириновые фотосенсибилизаторы – наиболее активные и биологически совместимые с человеческим организмом тетрапиррольные соединения. Для создания гелей и мазей, содержащих ПФС, используют нетоксичные полимеры, не участвующие в процессе ФДТ.

Ранее было показано, что в присутствии некоторых амфифильных полимеров эффективность ПФС при фотодинамическом воздействии на культуры опухолевых клеток, а также опухоли поверхностной локализации у лабораторных животных возрастает в раз ( патент РФ ). Использовали культуры нормальных и опухолевых клеток шести разных типов и 1000 крыс линии Вистар. Основная задача данной работы – создание препаратов на основе комплексов наноразмерных агрегатов порфиринов с амфифильными полимерами для фотодинамической терапии гнойных ран, осложненных ожогов, трофических язв.

Работа развивалась в трех направлениях – изучение механизмов влияния амфифильных полимеров на активность ПФС в модельных процессах фотоокисления, при фотодинамическом воздействии на клетки и исследование эффективности комплексов ПФС-АП при ФД-воздействии на раневые инфекции у лабораторных животных (крысы), а также при лечении хронических гнойных ран у больных. Объекты и методы В качестве фотосенсибилизаторов использовали димегин и фотодитазин - препарат, применяемый сейчас в клинической практике. Использовали три группы амфифильных полимеров разной мол.массы и химической природы, в том числе плюроники. 1. Модельные условия – фотоокисление триптофана. 1. Модельные условия – фотоокисление триптофана. 2. Испытания на животных: выполнены на 100 беспородных крысах-самцах с массой тела г. Объектом ФД-воздействия служила огнестрельная мягкотканная инфицированная рана в области средней трети правого бедра животных. 2. Испытания на животных: выполнены на 100 беспородных крысах-самцах с массой тела г. Объектом ФД-воздействия служила огнестрельная мягкотканная инфицированная рана в области средней трети правого бедра животных. 3. Эффективность гелей на основе комплексов полимер- фотодитазин исследовали при лечении 45 больных. 3. Эффективность гелей на основе комплексов полимер- фотодитазин исследовали при лечении 45 больных.

Димегин Фотодитазин Динатриев ая сол ь 2,7,12,18- тетраметил- 3,8 -ди ( 1 -метоксиэтил) - 13,17- ди ( 2- оксикарбонил этил) порфирина N-метил-ди-D- глюкаминов ая сол ь хлорина е6 I. Фотосенсибилизаторы: 2. Полимеры этиленоксид пропиленоксид Поливиниловый спирт СН2 СН 2. Поливиниловый спирт СН2 СН ОН ОН 1. Плюроник

I. Влияние плюроников на кинетику фотосенсибилизированного окисления триптофана Зависимость константы скорости фотоокисления триптофана ( моль/л), в присутствии димегина (а) и фотодитазина (б) от концентрации плюроников Р85 (1), F127 (2). [ПФС] моль/л. аб Таким образом, солюбилизация димегина повышает его активность в 1,5 раза, а фотодитазина в 6 раз. Соотношение концентраций плюроник/димегин при этом составляет 20:1; для фотодитазина –100:1. С увеличением концентрации плюроников их влияние на активность фотодитазина в модельных условиях резко уменьшается.

Влияние плюроников на агрегацию димегина и фотодитазина в воде по данным светорассеяния Распределение по размерам мицелл плюроника F127 ( моль/л) (а), (б); мицелл плюроника в присутствии моль/л димегина (в); агрегатов димегина в водном растворе (10 -6 моль/л), плюроника в присутствии фотодитазина (г). Фосфатный буфер, 37 о С. [ФД, ДМ] моль/л. При увеличении концентрации плюроника до моль/л средний размер мицелл не меняется. Размер агрегатов фотодитазина

Влияние фотодитазина на кристаллизацию плюроника (по данным АСМ) Агрегаты полимер-порфирин в твердой фазе достигают размеров нм, размеры ассоциатов фотодитазина 100 нм. а б Рельеф участкаповерхности (7х7мкм) плюроника F-127 (а) и его комплекса с фотодитазином (б), полученных при кристаллизациииз воды на слюде. Рельеф участка поверхности (7х7мкм) плюроника F-127 (а) и его комплекса с фотодитазином (б), полученных при кристаллизации из воды на слюде.

ВОЗМОЖНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ВЛИЯНИЯ АМФИФИЛЬНЫХ ПОЛИМЕРОВ НА ФОТОИНДУЦИРОВАННУЮ ЦИТОТОКСИЧНОСТЬ СЕНСИБИЛИЗАТОРОВ Влияние на проницаемость плазматической мембраны (повышение содержания порфиринов в клетке); Влияние на проницаемость плазматической мембраны (повышение содержания порфиринов в клетке); Стабилизация дефектов (пор) в мембране, вызванных воздействием синглетного кислорода. Стабилизация дефектов (пор) в мембране, вызванных воздействием синглетного кислорода. Влияние на клеточный метаболизм (торможение репаративных процессов); Влияние на клеточный метаболизм (торможение репаративных процессов);

ВЛИЯНИЕ ПОЛИМЕРОВ НА НАКОПЛЕНИЕ ФОТОДИТАЗИНА В КЛЕТКАХ Полимеры не влияют на количество фотодитазина, проникшего в клетки Полимеры не влияют на количество фотодитазина, проникшего в клетки - в отсутствие полимеров - в присутствии 0,1% Р85 (а) и ПВС (б) (а)(б)

ВЛИЯНИЕ МИЦЕЛЛ ПЛЮРОНИКА F127 НА РАЗМЕР ПОР МОДЕЛЬНОЙ ЛИПИДНОЙ МЕМБРАНЫ Оказалось (по данным кинетики «вытекания «карбоксифлуресцеина), что плюроники не влияют на размер пор липидных мембран, возникающих под действием 1 О 2. Схематичное изображение липидной мембраны со «встроенной» молекулой плюроника Гидрофобный пропиленоксидный блок Гидрофильные этиленоксидные фрагменты

Если влияние полимеров на фотоцитотоксичность ПФС обусловлено воздействием на клеточный метаболизм, то эффективность воздействия должна зависеть от длительности контакта полимеров и ПФС с клетками. Если влияние полимеров на фотоцитотоксичность ПФС обусловлено воздействием на клеточный метаболизм, то эффективность воздействия должна зависеть от длительности контакта полимеров и ПФС с клетками.

Инкубация 3 час Освещениелазером Гибельклеток Добавление ФД или смеси ФД + полимер Инкубация 2 суток Оказалось, что эффект проявляется, если добавить полимер вместе с ФД за 3 часа до облучения. Если после инкубации отмыть полимер перед освещением, эффект исчезает или проявляется в малой степени. Добавление полимера после освещения не меняет процент гибели клеток. Оказалось, что эффект проявляется, если добавить полимер вместе с ФД за 3 часа до облучения. Если после инкубации отмыть полимер перед освещением, эффект исчезает или проявляется в малой степени. Добавление полимера после освещения не меняет процент гибели клеток. апоптоз некроз Гибельклеток Схема эксперимента по изучению влияния времени экспонирования клеток с плюроником F127 и фотодитазином на величину обнаруженного эффекта.

В присутствии амфифильных полимеров клетки гибнут по механизму некроза Механизмы гибели опухолевых клеток при ФДТ

2. Заживление огнестрельных ран у крыс при фотодинамической терапии с использованием комплексов фотодитазин-поливиниловый спирт Группа животныхИсчезновен ие признаков воспаления (сутки) Очищение от детрита (сутки) Появление грануляци й (сутки) Полное заживление (сутки) Контрольная (хлоргексидин) 13,3 1,413,0 0,514,1 0,934,3 1,7 1-я опытная (ХЛ- раствор, 0,05мг/мл) 12,2 1,312,9 1,113,3 1,733,8 1,3 2-я опытная ( ФД- раствор, 10мг/мл) 11,4 1,412,7 1,512,4 1,132,1 1,6 3-я опытная ( ХЛ- гель, 0,05мг/мл ) 10,9 1,511,2 1,611,6 1,331,8 1,5 4-я опытная (ФД- гель, 10мг/мл) 7,3 0,96,5 0,16,1 0,425,2 1,5 5-я опытная (гель ПВС-ФД, 0,1мг/мл) 5,8 0,69 5,3 0,7 5,5 0,3 22,2 0,6

3. Комплексы полимер-фотодитазин в лечении гнойных ран у больных 3.1. Распределение больных по группам в зависимости от лечения фармакологических форм фотодитазина Методы лечения Количество больных Количес тво Доля от общего количества, % 1 Традиционное лечение (контрольная группа) ФДТ с использованием 1% раствора фотодитазина ФДТ с использованием 1% фотодитазина в геле Гель ПВС-ФД (0,1% фотодитазин) Всего130100

3.2. Сроки очищения ран от гнойно-некротических масс, появления грануляций и краевой эпителизации Метод лечения Сроки, сутки Очищени е Появление грануляци й Краевая эпители зация Традиционное лечение6,5±0,77,8±0,67,8±1,2 ФДТ с использованием 1% раствора фотодитазина в 25%- ном димексиде 4,1±0,54,7±0,46,1±0,4 ФДТ с использованием 1% фотодитазина в геле 3,6±0,3 5,1±0,5 Гель ПВС-ФД (0,1% фотодитазин) 2,3±0,52,4±0.54,0±0,7

Применение комплекса плюроник F127 - фотодитазин (0,1%ФД) при лечении гнойно- некротической раны лопаточной области Исходное состояние после некроэктомии На 2-сутки после воздействия комплекса и облучения (рана очистилась) На 9 - сутки произошла эпителизация

ВЫВОДЫ В процессе фотоокисления триптофана наиболее активны комплексы плюроник-фотодитазин, средние размеры которых составляют нм, менее активны системы плюроник-димегин, средние размеры которых нм; В процессе фотоокисления триптофана наиболее активны комплексы плюроник-фотодитазин, средние размеры которых составляют нм, менее активны системы плюроник-димегин, средние размеры которых нм; Наиболее вероятый механизм эффективности наноразмерных комплексов плюроник-порфирин в ФДТ- влияние на клеточный метаболизм ; Наиболее вероятый механизм эффективности наноразмерных комплексов плюроник-порфирин в ФДТ- влияние на клеточный метаболизм ; В присутствии плюроника гибель клеток протекает только по механизму некроза; В присутствии плюроника гибель клеток протекает только по механизму некроза; Комплексы амфифильных полимеров с фотодитазином эффективнее ряда имеющихся средств лечения гнойных ран и кожных повреждений; Комплексы амфифильных полимеров с фотодитазином эффективнее ряда имеющихся средств лечения гнойных ран и кожных повреждений; Использование комплексов амфифильный полимер- фотодитазин наряду с повышением эффективности ФД- воздействия позволяет в снизить концентрацию фотосенсибилизатора. Использование комплексов амфифильный полимер- фотодитазин наряду с повышением эффективности ФД- воздействия позволяет в снизить концентрацию фотосенсибилизатора.