Различные типы ФКУ и методы их молекулярной диагностики.

Фенилкетонурия – частое врожденное нарушение метаболизма аминокислот, в основе которого лежит дефицит печеночного фермента фенилаланингидроксилазы, осуществляющего превращение фенилаланина. Основным клиническим симптомом фенилкетонурии, без своевременного начатого лечения, является задержка психо-речевого и физического развития и, как следствие, слабоумие, ведущее к тяжелой психической инвалидности.

Распространенность ФКУ в различных популяциях мира, по данным массового скрининга Популяция Частота носителей Частота заболевания Авторы Турция1:261:2600 Ozalp et al., 1986 Ирландия1:331:4500 DiLella et al., 1986 Восточная Европа 1:501: Scriver & Kaufman, 2001 Япония1:2001: Aoki & Wada, 1988 Финляндия1:2251: Scriver & Kaufman, 2001

ФЕНИЛКЕТОНУРИЯ Классическая Повреждении в гене фенилаланингидроксилазы (PAH) 98% Атипичная Повреждения в генах синтеза и обмена тетрогидробиоптерина (ВН4) (PTS, QDPR и др.) 2%

Частота встречаемости наиболее частых мутаций среди больных в мире ( в Европейских популяциях (Zschocke J., 2003 ) 42% 63%

Система регистрации наиболее частых мутаций R252W R261Q Norm IVS12+1g>a Norm R408W 11ex Norm IVS10-11g>a 3ex Norm I65T P281L 7ex Norm R158Q 5ex Norm А) одна пара праймеров и две эндонуклеазы рестрикции Б) две пары праймеров и одна эндонуклеаза рестрикции

Структура выборки (N=302) Воронежская область46 человек Свердловская область33 человека Самарская область23 человека Курская область23 человека Вологодская область20 человек Архангельская область24 человека Удмуртия28 человек Московская область47 человек Пациенты научно- консультативного отделение ГУ МГНЦ РАМН 58 человек

Частота встречаемости наиболее частых мутаций в Российских популяциях 79,1%

Частота распространения наиболее частых мутаций в мире, в Европейских популяциях и в исследуемых российских популяциях больных ФКУ

. Фрагмент сиквенса экзона 7 гена РАН, образца ДНК больного ФКУ из Воронежской области. Замена G на Т в 781 основании гена РАН приводящая к преждевременному стоп кодону в 261 кодоне (Arg261Stop). Стрелкой обозначена мутация R261X. SSCP-анализ экзона 7 гена PAH Стрелкой обозначено изменение электрофоретической Подвижности соответствующее мутации R261X.

экзон 1 экзон 3 экзон 2 экзон 5 экзон 9 экзон 10 экзон 11 экзон 12 экзон 13 экзон 7 экзон 8 экзон 6 экзон 4 p.F39del L48S IVS2+5g>a IVS2-13t>g IVS4+5g>t del nt A132V A165V R243X E256D R261X E280K IVS7+1g>a L348V S349P IVS10-14c>g E390D IVS11+1g>c R408Q Y414C I421N Структура гена PAH и локализация обнаруженных мутаций в гене PAH Суммарная информативность 87,2%

Полиморфные маркеры внутри и непосредственной близости от гена PAH STR VNTR PAH 26 STR 76kb VNTR STR PAH 26 STR Гетерозиготность 75% Гетерозиготность 72% Гетерозиготность 70%

Исследование в гене PAH Количество человек Обнаружены обе мутации в гене PAH 233 Обнаружены одна мутация в гене PAH 58 Мутаций в гене PAH не обнаружены 11

Синтез и метаболизм тетрагидробиоптерина PTPS DHPR PAH Гуанозинтрифосфат (GTP) Дигидроптеринтрифосфат 6-пировоилтетрагидроптерин Тетрагидробиоптерин q-Дигидроптерин 4а-карбиноламин Фенилаланин Тирозин Дофамин Триптофан 5-ОН-Триптофан Серотонин Птерин-

Ген QDPR локализован на хромосоме 4 в районе p15.3 Ген PTS расположен хромосоме 11 в районе q PTS GCH1 PCBD QDPR

AGT TAG 2,7kb1,9kb 10kb 2,5kb 1,7kb экзон 1 экзон 2 экзон 3 экзон 4 экзон 5 экзон 6 A135D экзон 7 2,7kb Структура гена QDPR и локализация обнаруженных мутаций в гене QDPR

Структура и локализация обнаруженных мутаций в гене PTS 2,0kb 1,5kb 0,4kb 2,5kb0,2kb экзон 1 экзон 2 экзон 3 экзон 4 экзон 5 экзон 6 AGT TAG N72K V59G S32G IVS5-1g>a T106M g.7068G>A

МутацияКол-во хромосо м ГенЭкзон/ Интрон Информ ат. A135D2 QDPR Экзон 4 41,6% N72K2 PTS Экзон 4 T106M2 PTS Экзон 6 S32G1 PTS Экзон 2 V59G1 PTS Экзон 3 IVS5-1g>a1 PTS Интрон 5 g.7068G>A1 PTS Экзон 6

Больной ВН4- зависимой формой ГФА Диета с пониженным содержанием ФА Умственная отсталость и тяжелые неврологические нарушения Комбинированное лечение диета с пониженным содержанием ФА медиаторы ВН4 Отсутствие неврологической симптоматики

Практическое применение С помощью разработанной системы регистрации наиболее частых мутаций в гене PAH проведено: 216 диагностики гетерозиготного носительства мутаций в гене PAH : 1 62 диагностики провели для индивидов, не имеющих в семье больного ФКУ (планирование беременности) :обнаружено 4 гетерозиготных носителя мутаций в гене PAH 54 диагностики в семьях больных ФКУ: обнаружено 26 гетерозиготных носителя мутаций в гене PAH 67 пренатальных диагностик, из них: В семи случаях плод унаследовал те же хромосомы, что и больной ребенок В 46 случае плод являлся гетерозиготным носителем заболевания В 14 случаях плод не унаследовал мутации в гене PAH

Диагностика недостаточности тетрагидробиоптерина : Подтвержден диагноз « BH4 – зависимая форма ГФА », найдены мутаци и в гене PTS Методом SSCP-анализа с последующим секвенированием проведена Практическое применение

Повышенный уровень ФА, клинические проявления ГФА Молекулярно-генетическое исследование гена PAH с помощью системы обнаружения наиболее частых мутаций Обнаружены обе мутации в гене PAH Обнаружена одна мутация в гене PAH Мутаций в гене PAH не обнаружено Косвенная диагностика с использованием полиморфных маркеров, расположенных внутри и непосредственной близости от гена PAH SSCP-анализ всей кодирующей последовательности гена PAH и областей интрон-экзонных соединений Обнаружены обе мутации в гене PAH Обнаружена одна мутация в гене PAH Мутаций не обнаружено SSCP-анализ всей кодирующей последовательности и областей интрон-экзонных соединений генов PTS и QDPR Семья информативна, возможно проведение пренатальной диагностики и выявление гетерозиготных носителей среди родственников Схема молекулярно-генетической диагностики гиперфенилаланинемии 69,2% 100%