МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ УКРАИНЫ Национальный технический университет Украины Факультет биотехнологии и биотехники; Институт молекулярной биологии. - презентация

1 МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ УКРАИНЫ Национальный технический университет Украины Факультет биотехнологии и биотехники; Институт молекулярной биологии и генетики НАН Украины, Киев Отдел геномики человека Использование методов ДНК-анализа для диагностики моногенных наследственных заболеваний Островной Денис Владимирович

2 2 Фенилкетонурия Одним из наиболее распространенных наследственных заболеваний является фенилкетонурия Одним из наиболее распространенных наследственных заболеваний является фенилкетонурия В Украине на 8300 новорожденных один ребенок рождается больной ФКУ В Украине на 8300 новорожденных один ребенок рождается больной ФКУ

3 3 Фенилаланингидроксилаза катализирует реакцию преобразования фенилаланин + О 2 + тетрагидробиоптерин фенилаланин + О 2 + тетрагидробиоптерин тирозин + вода + окисленный биоптерин

4 4 Цель работы Провести ДНК-анализ мутаций и полиморфизма гена ФАГ и оптимизировать проведения полимеразной цепной реакции для амплификации in vitro последовательности ДНК седьмого экзона этого гена. Провести ДНК-анализ мутаций и полиморфизма гена ФАГ и оптимизировать технологию проведения полимеразной цепной реакции для амплификации in vitro последовательности ДНК седьмого экзона этого гена.

5 5 Для достижения цели были поставлены основные задачи исследования: ДНК-анализ мутаций ДНК-анализ мутаций R408W, R158Q, Y414C, IVS10nt546, IVS12nt1 гена ФАГ R408W, R158Q, Y414C, IVS10nt546, IVS12nt1 гена ФАГ ДНК-анализ мутаций в последовательности 7-го экзона гена ФАГ ДНК-анализ мутаций в последовательности 7-го экзона гена ФАГ Анализ алельного полиморфизма VNTR-локуса 3`-нетранслированой области гена ФАГ Анализ алельного полиморфизма VNTR-локуса 3`-нетранслированой области гена ФАГ

6 6 Объект и предмет исследования Объект исследования - ДНК человека полученная из лейкоцитов периферической крови Предмет исследования – анализ мутаций в 5, 7, 12 экзоне и 10, 12 интроне гена ФАГ

7 7 Методы: Выделение и очистка ДНК; Выделение и очистка ДНК; амплификация in vitro последовательностей гена ФАГ методом полимеразной цепной реакции; амплификация in vitro последовательностей гена ФАГ методом полимеразной цепной реакции; рестрикционный анализ ПЦР-продуктов; рестрикционный анализ ПЦР-продуктов; гель-электрофорез гель-электрофорез

8 8 Этапы Этапы ДНК-анализа: Выделение геномной ДНК из образцов венозной крови методом фенольной экстракции; Амплификация in vitro фрагмента ДНК с помощью полимеразной цепной реакции; Гидролиз ПЦР-продуктов при помощи эндонуклеаз рестрикции; Гель-электрофорез в агарозном и полиакриламидном геле.

9 9 Схема рестрикционного анализа для детекции мутаций R408W эндонуклеазой рестрикции Eco1301 Сайт узнавания Eco1301 CC Фрагмент нормальной последовательности Фрагмент последовательности с мутацией -A-T-A-C-C-T-C-G-G-C-C-C -T-A-T-G-G-A-G-C-C-G-G-G : : : : : : : : : : : : -A-T-A-C-C-T-T-G-G-C-C-C -T-A-T-G-G-A-A-C-C-G-G-G : : : : : : : : : : : : Eco1301 -A-T-A-C C-T-T-G-G-C-C-C -T-A-T-G-G-A-A-C C-G-G-G : : : : : : : : 245 п. н. 148 п. н. 97 п. н. AA TT GG -A-T-A-C-C-T-C-G-G-C-C-C -T-A-T-G-G-A-G-C-C-G-G-G : : : : : : : : : : : : Сайт узнавания Eco1301

10 10 Анализ мутации R408W п.н. 148 п.н. 97 п.н. 1, 2 – R408W/норма, 3 – норма/норма, 4 – R408/R408W.

11 11 : : : : : : : : : : : : -A-A-G-C-C-G G-A-A-G- -T-T-C-G G-C-C-T-T-C- 123 п. н. 19 п. н. Фрагмент нормальной последовательности Фрагмент последовательности с мутацией R158Q -A-A-G-C 3`-T-T-C-T-G-C-C-T-T-C-5`-T-T-C-T-G-T-C-T-T-C- -A-A-G-C-C-A-G-A-A-G- 142 п. н. : : : : : : : : : : -T-T-C-G-G-T-C-T-T-C- 5`-A-A-G-C-3` -T-T-C-G-G-C-C- T-T-C- 3`-T-T-C-T-G-C-C-T-T-C-5` : : : Рестрикция MspI MspI Схема рестрикционного анализа для детекции мутаций R158Q эндонуклеазой рестрикции MspI 5`-A-A-G-C-3` : : : : : : : : : : -A-A-G-C-C-A-G-A-A-G- -T-T-C-G-G-T-C-T-T-C- 3`-T-T-C-T-G-T-C-T-T-C-5` : : : MspI Сайт узнавания MspI Отжиг праймера с неполной гомологией на 3`-конце Амплификация фрагмента ДНК с созданием сайта рестрикции для MspI : : : : : : -C-G-G-A-A-G-

12 12 Анализ мутации R158Q. 123 п.н. 119 п.н , 2 - R158Q/норма; 3, 4 - норма/норма.

13 13 На первом этапе мы рассматривали четыре паралельно протикающие реакции: 1. ДНК+Pr ДНК. Pr Образование комплекса ДНК. Pr 2. ДНК. Pr ДНК+Pr Разрушение комплекса ДНК. Pr 3. ДНК+Pr ДНК *. Pr Образование комплекса ДНК*. Pr с неполной гомологией 4. ДНК *. Pr ДНК+Pr Разрушение комплекса ДНК *. Pr с неполной гомологией

14 14 Концентрации реагентов описываются системой диф. уравнений: Решив данную систему мы получили:

15 15 График зависимости концентрации ssДНК и комплексов ДНК. Pr, ДНК. Pr* от времени x(t) – C(ssDNA) y(t) – C(ssDNA. Pr) z(t) – 10*C(ssDNA *. Pr)

16 16 На втором этапе мы рассматривали шесть паралельно протикающие реакции: 1.ДНК+Pr ДНК. Pr Образование комплекса ДНК. Pr 2.ДНК. Pr ДНК+Pr Разрушение комплекса ДНК. Pr 3.ДНК+Pr ДНК *. Pr Образование комплекса ДНК*. Pr с неполной гомологией 4.ДНК *. Pr ДНК+Pr Разрушение комплекса ДНК *. Pr с неполной гомологией 5.ssДНК. Pr + dNTP ДНК + H 3 PO 4 Образование двухцепочечной спирали ДНК 6.ssДНК *. Pr + dNTP ДНК* + H 3 PO 4 Образование двухцепочечной спирали ДНК

17 17 Данные процессы описываются системой диф. уравнений:

18 18 Оптимальный температурный режим отжига праймеров описывается формулой T= e τ

19 19 Зависимость концентрации ssDNA, DNA.Pr, DNA.Pr* и специфичности от времени, при температуре T=58С Где: X – концентрация одноцепочечных молекул ДНК; Y - кон. комплексов ДНК. Пр; Z - кон. не специфических скомплексов ДНК. Пр; A - кон. специфического ПЦР продукта; B - кон. не специфического ПЦР продукта; S – отношение специфического ПЦР продукта к неспецифическому; S1 – отношение специфического ПЦР продукта к неспецифическому, рассчитаная при условии что специфические и не специфические комплексы превратятся в ПЦР продукт при элонгации.

20 20 Зависимость концентрации ssDNA, DNA.Pr, DNA.Pr* и специфичности от времени, при изменении температуры по формуле T= e τ Где: X – концентрация одноцепочечных молекул ДНК; Y - кон. комплексов ДНК. Пр; Z - кон. не специфических скомплексов ДНК. Пр; A - кон. специфического ПЦР продукта; B - кон. не специфического ПЦР продукта; S – отношение специфического ПЦР продукта к неспецифическому; S1 – отношение специфического ПЦР продукта к неспецифическому, рассчитаная при условии что специфические и не специфические комплексы превратятся в ПЦР продукт при элонгации.

21 21 AvaI Схема рестрикционного анализа для детекции мутаций R252W (эндонуклеаза рестрикции AvaI). -T-C-C-T-C-T-C-G-G-G-A-T-T- -A-G-G-A-G-A-G-C-C-C-T-A-A- : : : : : : : : : : : : : AvaI 169 п. н. 113 п. н.56 п. н. Сайт узнавания AvaI C CG G Фрагмент нормальной последовательности Фрагмент последовательности с мутацией R252W CTCT GAGA -T-C-C-T-C-T-T-G-G-G-A-T-T- -A-G-G-A-G-A-G-C-C-C-T-A-A- : : : : : : : : : : : : : -T-C-C-T-C T-C-G-G-G-A-T-T- -A-G-G-A-G-A-G-C-C C-T-A-A- : : : : : : : : : Сайт узнавания AvaI -T-C-C-T-C-T-T-G-G-G-A-T-T- -A-G-G-A-G-A-G-C-C-C-T-A-A- : : : : : : : : : : : : :

22 22 Анализ мутаций R252W 1 - R252W/норма 2 - норма/норма М - Маркер молекулярной массы 1 2 М 113 п.н. 147 п.н. 169 п.н.

23 23 Электрофореграмма продуктов амплификации VNTR –полиморфизма М 1 - генотип 3/3 (380/380 п.н.); 2 - генотип 3/7 (380/500 п.н.); 3 - генотип 3/8 (380/530 п.н.); 4 - генотип 9/12 (560/650 п.н.); M - Маркер молекулярной массы ДНК плазмиды pBR322 гидролизированная эндонуклеазой MspI

24 24 Выводы 1. Проведен ДНК-анализ мутаций R408W, IVS12nt1, R158Q, Y414C, IVS10nt546 гена ФАГ в 68 образцах. Двадцать три из них в дальнейщем использовались в качестве ДНК-матрици для амплификации седьмого экзона гена ФАГ. 2.Подобраны условия для амплификации in vitro и рестрикции последовательности седьмого екзона гена ФАГ. T= e τ 3. Рассчитана математическая модель отжига праймеров и предложен оптимальный температурный режим амплификации который представлен в виде функции T= e τ. 4. Проведен анализ аллельного полиморфизма VNTR-локуса гена ФАГ с использованием специфической амплификации in vitro последовательности 3'-нетранслированного участка этого гена. 5. Проведенные иследования позволили оптимизировать анализ идентифицируемых мутаций для проведения пренатальной ДНК- диагностики фенилкетонурии с целью предупреждения рождения больных детей.

25 25 Автор выражает благодарность: биотехнологии и биотехники. Преподавателям факультета биотехнологии и биотехники. отдела геномики человекаИнститута молекулярной биологии и генетики НАН Украины Сотрудникам отдела геномики человека Института молекулярной биологии и генетики НАН Украины Лившиц Людмиле Аврамовне Нечипоренко Марине Владимировне Кравченко Сергею Афанасьевичу Помпуха Владимиру Николаевичу Грищенко Наталье Владимировне Ясинской Ольге Анатольевне Сима Любовь Викторовне