Принципы генной терапии автор - к.б.н. Лазарев В.Н."

Молекулярная медицина Генная терапия Генная диагностика Принципы генной терапии

Генная терапия -новая область современной биомедицины, основанная на введении в организм больного рекомбинантных генетических конструкций с лечебной целью. Принципы генной терапии

- введение ретровирусного вектора, экспрессирующего ген аденозиндеаминазы (ADA) (частота встречаемости 1: ) двум больным, страдающим комбинированным иммунодефицитом ADA-SCID (недостаточность аденозиндеаминазы) (National Institute of Health (NIH), Bethesda, USA) 14 сентября 1990 г.

Принципы генной терапии

Классификация генной терапии 1) по типу клеток-мишеней: соматическая фетальная Принципы генной терапии

Классификация генной терапии 2) по цели воздействия: позитивная ( компенсация экспресcии гена) негативная (подавление функций гена) Принципы генной терапии

Классификация генной терапии 3) по тактике введения генотерапевтического агента: ex vivo ( клетки крови) in situ (локально) in vivo (системное введение) in utero (введение конструкций в эмбрион) Принципы генной терапии

Классификация генной терапии 4) по типу векторной системы: вирусные векторы невирусные векторы микроинъекция gene gun (генный пистолет) Принципы генной терапии

Классификация генной терапии 5) по применяемым агентам: нуклеиновые кислоты белки иммунотерапия Принципы генной терапии

Классификация генной терапии по типу клеток- мишеней соматическая фетальная по цели воздействия позитивная негативная по тактике введения агента ex vivo (клетки крови) in situ (локально) in vivo (системно) in utero (эмбрион) по типу векторной системы вирусные векторы невирусные векторы микроинъекция генное ружье по типу агента нуклеиновые кислоты белки иммунотера пия

Смена парадигм генной терапии от «генетической» к генной терапии от «пересадки» генов к пересадке клеток от вирусных к невирусным векторам Принципы генной терапии

Генотерапевтические агенты

Нуклеиновые кислоты – генотерапевтические агенты Антисенс ДНК и РНК Рибозимы Peptide – nucleic acids (PNA) РНК - ловушки

Антисенс ДНК и РНК

Преимущества: относительная специфичность дуплекса возможность экспрессии в составе любого вектора отсутствие иммуногенности Недостатки: быстрая деградация (РНКазы, ДНКазы) в клетке

Рибозимы Сайт расщепления NUY N – любой нуклеотид Y – любой, кроме G Типы: 1)Головка молотка 2)Шпилька 3)Интроны группы I, II

Рибозимы Преимущества: каталитические свойства (расщепление мишени) в процессе взаимодействия с мишенью молекулы не расходуются (ингибирование экспрессии гена – мишени при низких концентрациях) отсутствие иммуногенности индукция интерферона Недостатки: быстрая деградация (РНКазы, ДНКазы) в клетке Возможно создание модифицированных рибозимов

Peptide – nucleic acids (PNA) 1.Дуплексы DNA/PNA более стабильны, чем дуплексы DNA/RNA 2.Дуплексы DNA/PNA не подвержены действию RNase H, протеаз, пептидаз

РНК - ловушки Гиперэкспрессия коротких РНК (РНК – ловушки), направленных на cis – активаторные регуляторные элементы, могут использоваться как ловушки для trans – активаторных белков. Механизм действия - блокирование связывания трансактиваторных белков вируса с регуляторными элементами

Белки – генотерапевтические агенты Трансдоминантные негативные белки Одноцепочечные антитела (intrabodies) Суицидные гены

Трансдоминантные негативные белки Трансдоминантные негативные белки – мутантная версия регуляторных или структурных белков Механизм действия: 1)Конкуренция за субстраты и кофакторы 2)Образование нефункциональных мультимерных комплексов

Трансдоминантные негативные белки Преимущества: возможность использования в составе невирусных векторов Недостатки: иммуногенность Использование в качестве ТНБ клеточных (невирусных) белков

Одноцепочечные антитела Новый класс генотерапевтических агентов. Одноцепочечные вариабельные фрагменты антител с сохраненными свойствами антиген-специфичности, получаемые клонированием и экспрессией генов легких и тяжелых цепей антител А) Вариабельные домены тяжелой (VH) и легкой (VL) цепей (около 110 а.а.) B) Домены соединены гибким линкером (глицин(4)-серин(3)) C) Использование домена Ck легкой цепи разрешает димеризацию – увеличение активности и стабильности

Одноцепочечные антитела Преимущества: возможность экспрессии в гетерологичных системах сохранение всех свойств классических антител Недостатки: отсутствие возможности к секреции (связаны с эндоплазматической сетью) Использование сигнальных последовательностей позволяет одноцепочечным антителам секретироваться

Суицидные гены Вместо ингибирования (или компенсации) функции дефектного гена возможно использование суицидных генов, экспрессия которых вызывает гибель клетки-мишени Примеры: А-цепь дифтерийного токсина ген цитозиндеаминазы ген тимидинкиназы вируса простого герпеса (HSV tk)

Суицидные гены

Bystander effect («эффект свидетеля» 1)Распространение токсичных продуктов фосфорилирования GCV через межклеточные щелевые контакты 2)Индукция специфического иммунитета 3)Фагоцитоз апоптических везикул, содержащих метаболиты GCV Результат - гибель соседних клеток (генная терапия опухолей)

Суицидные гены Экспрессия гена HSV tk (в виде составного белка с GFP) приводит к гибели клеток по механизму апоптоза

Иммунотерапия ДНК – вакцины Антиген – специфичные Т лимфоциты

ДНК - вакцины Плазмидный вектор для экспрессии HBs антигена Способы введения: 1)Внутрикожно 2)Подкожно 3)Внутримышечно 4)? Внутривенно

ДНК - вакцины Преимущества: дешевизна производства отсутствие иммуногенности (? Анти-ДНК антитела) экспрессия продукта гена в нативной форме индукция Т-клеточного иммунитета Недостатки: низкая эффективность доставки низкая емкость векторов высокая вероятность интеграции в геном клетки

Принципы генной терапии Знаем: что лечить Знаем: чем лечить Не знаем: КАК ЛЕЧИТЬ?

Системы доставки генетического материала Принципы генной терапии

Системы доставки генетического материала Векторы вирусныеневирусные

Системы доставки генетического материала Вирусные векторы: ретровирусы аденовирусы аденоассоциированный вирус герпесвирусы лентивирусы и др.

Вирусные векторы - достоинства: трансфекция большого количества клеток тропизм неспособность реплицироваться в клетке-хозяине устойчивость к деградации лизосомами Системы доставки генетического материала

Вирусные векторы - недостатки: иммуногенность (аденовирусы, герпесвирусы) потенциальная туморогенность (ретровирусы) Системы доставки генетического материала

Системы доставки генетического материала Аденовирусы

Преимущества: способны инфицировать неделящиеся клетки большая клонирующая емкость (в настоящее время - до 28 т.п.о.) низкая вероятность встраивания в геном клетки- мишени относительная простота производства высокий титр при продукции в пермиссивных клеточных линиях

Недостатки: ИММУНОГЕННОСТЬ ( иммунный ответ развивается через 2-3 инъекции) транзиентная экспрессия целевых генов Аденовирусы

Аденовирусные векторы трансген трансфекция Е1 Хромосома клетки - хозяина трансген трансген лизис

Системы доставки генетического материала Ретровирусы

Преимущества: не иммуногенны постоянная экспрессия целевых генов

Недостатки: инфицируют только делящиеся клетки потенциальная туморогенность низкий титр небольшая клонирующая емкость (около 3.5 т.п.о.) Ретровирусы

инфицирование клетки-мишени синтез ДНК-копии генома с помощью обратной транскриптазы транспорт вирусной ДНК в ядро встраивание вирусной ДНК в хромосому клетки транскрипция мРНК с вирусной ДНК под контролем 5`-LTR промотора трансляция белков Gag, Pol, Env в цитоплазме образование вирусного капсида и упаковка двух цепей РНК и обратной транскриптазы высвобождение вирионов из клетки Жизненный цикл ретровирусов

Интеграция

Ретровирусные векторы gag 5`-LTR 3`-LTR + pol env 5`-LTR 3`-LTR + Ген X neo Пакующая клеточная линия Плазмидный вектор с пакующим сигналом + Трансфекция продуцирующей линии клеток Упакованная РНК

Системы доставки генетического материала Невирусные системы

Невирусные системы доставки прямая инъекция рецепторо-опосредованный эндоцитоз генное ружье липофекция электропорация полимерные носители

Плазмидные векторы - достоинства: отсутствие токсичности и мутагенности практически неограниченная емкость вектора практически неограниченная емкость вектора дешевизна производства дешевизна производства Невирусные системы доставки

Плазмидные векторы - недостатки: трансфекция ограниченной популяции клеток деградация ДНК лизосомами деградация ДНК лизосомами отсутствие тропизма отсутствие тропизма ( в настоящее время есть перспективные разработки) Невирусные системы доставки

Обобщенная схема плазмидного вектора для генной терапии Невирусные системы доставки

Коммерчески доступные плазмидные векторы InvivoGen, San Diego, USA Невирусные системы доставки

Промоторы: ранний промотор цитомегаловируса человека (HCMV) тетрациклин-зависимый промотор CMV промотор вируса саркомы Рауса (RSV) главный поздний промотор аденовируса человека 5 типа (MLP) Невирусные системы доставки

Маркерные гены: SEAP (secreted alkaline phosphatase) SEAP (secreted alkaline phosphatase) - galactosidase - galactosidase G418 (neomycin) G418 (neomycin) GFP (green fluorescent protein) GFP (green fluorescent protein) Невирусные системы доставки

Экспрессия гена GFP (green fluorescent protein) в линии клеток 293 ex nm em nm

Экспрессия гена GFP (green fluorescent protein) в клетках E.coli ex nm em nm

Физические методы доставки рекомбинантных плазмидных векторов: прямая инъекция «голого» гена в ткань (ДНК-вакцинация) кальций-фосфатная трансфекция липофекция электропорация Невирусные системы доставки

Принцип действия Effecten Transfection Reagent (QIAGEN, Germany)

Рецепторо – опосредованный эндоцитоз Смешанные системы доставки

Вирус -липосомы

Смешанные системы доставки Бактериофаги лиганд

Генная терапия в медицине

Клинические испытания генотерапевтических препаратов. I фаза. Оценка токсичности генной конструкции. II фаза. Ограниченные испытания на небольшом контингенте больных. III фаза. Широкомасштабные мультицентровые клинические испытания.

Начальные стадии внедрения генотерапевтических протоколов

Зарегистрировано 636 клинических протоколов генной терапии 3496 пациента имеют в своем организме генетически модифицированные клетки Клинические испытания генотерапевтических препаратов.

63,4 % протоколов и 68,4 % пациентов - генная терапия злокачественных новообразований (цитокины и суицидные гены) 12,3 % и 8,8% - генная терапия моногенных наследственных болезней 6,4% и 11,7% - генная терапия инфекционных заболеваний Клинические испытания генотерапевтических препаратов.

Из 636 генотерапевтических проектов: 420 проектов (66%) - I фаза клинических испытаний 134 проекта (21,1%) - между I и II фазами клинических испытаний 4 проекта (0,6%) - III фаза клинических испытаний

Современное состояние генной терапии

После резекции в ложе опухоли вносятся мышиные клетки РА317, продуцирующие ретровирусный вектор, экспрессирующий ген тимидинкиназы вируса простого герпеса. Через неделю больным вводится препарат ганцикловир, который после фосфорилирования in situ обрывает синтез ДНК в быстроделящихся клетках. Genetic Therapy, Inc./Novartis Генная терапия глиобластомы головного мозга. III фаза клинических испытаний

Генная терапия глиобластомы головного мозга. Реализуемые механизмы: прямой эффект фосфорилированного ганцикловира «bystander effect» - гибель соседних опухолевых клеток за счет проникновения токсического продукта (трифосфат ганцикловира) локальное воспаление как результат введения мышиных клеток системный иммунный ответ

III фаза клинических испытаний Генная терапия остеосаркомы (ESCCHN) (2 протокола) Частота встречаемости случаев в год (США) Предпосылки - более 50% пациентов, имеют повышенный уровень экспрессии мутантной формы р53 Генотерапевтический агент - фактор супрессии опухоли (кДНК р53) Вектор – аденовирус тип 5 Способ введения - прямая инъекция в опухоль Увеличение выживаемости в 2 раза

III фаза клинических испытаний Генная терапия остеосаркомы (ESCCHN)

III фаза клинических испытаний Генная терапия метастатической меланомы (иммунотерапия) Генотерапевтический агент - HLA-B7/Beta-2 Microglobulin cDNA Презентация антигенов MHC класса I на поверхности опухолевой клетки после экспрессии HLA-B7/Beta-2 Microglobulin cDNA Вектор - плазмидная ДНК в комплексе с катионными липосомами и DMRIE-DOPE Способ введения – прямая инъекция в опухоль 31% пациентов не имели возврата опухоли в течение 6 лет

Первый трагический случай Смерть в сентябре 1999 г. Джесси Гелзингера (США). Страдал недостаточностью орнитинкарбамоил-трансферазы (ОКТ). Смерть наступила после третьей инъекции аденовирусного вектора последнего поколения, экспрессирующего ген ОКТ. Вскрытие показало атрофию внутренних органов по механизму апоптоза. Новое явление взаимодействия вирусного и человеческого генома?

муковисцидоз (кистозный фиброз поджелудочной железы) - перенос гена МТР (муковисцидозный трансмембранный регулятор) с помощью аденовирусного вектора и липосом. мышечная дистрофия Дюшена - введение нормальных копий кДНК гена дистрофина с помощью ретровирусных векторов. рестеноз (повторное сужение просвета артерии после ангиопластики) - введение в сосуд гена сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF) в виде плазмидной ДНК. ПРИМЕРЫ:

БолезньДефектный генКлетки- мишени ИммунодефицитАденозиндезаминазаЛимфоциты Семейная гиперхолестеринемия Рецептор липопротеинов низкой плотности Гепатоциты Гемофилия ВФактор IXФибробласты Эмфизема легкихА-1-антитрипсинЛимфоциты ФенилкетонурияФенилаланин - гидроксилаза Гепатоциты

БолезньДефектный генКлетки- мишени Талассемияb- глобинЭритробласты Респираторный дистресс-синдром Сурфактант белок ВЭпителий бронхов Болезнь АльцгеймераБелок- предшественник в- амилоида (ААР) Нервные клетки Болезнь ПаркинсонаТирозингидроксилазаМиобласты, фибробласты, нервные клетки ПРИМЕРЫ:

Основные подходы в генокоррекции онкологических заболеваний ПринципВводимые гены Повышение иммунореактивности опухоли Гены чужеродных антигенов, цитокины Генетическая модификация иммунных клеток Гены цитокинов, ко- стимуляторов Доставка генов «чувствительности», суицидных генов Тимидинкиназа HSV, ген аденозиндезаминазы Блокирование экспрессии онкогенов Антисмысловые РНК, одноцепочечные антитела Доставка генов-супрессоров опухолей р53 Защита интактных клеток от химиотерапии Гены лекарственной устойчивости тип 1

ПринципВводимые гены Индукция синтеза противоопухолевых веществ нормальными клетками Гены интерлейкина-2, интерферона Продукция противоопухолевых рекомбинантных вакцин Трансфекция дендритных клеток, вакцины типа БЦЖ, экспрессирующие противоопухолевый антиген Локальная радиопротекция нормальных тканей с помощью антиоксидантов Гены трансфераз, глутатион- синтетазы Основные подходы в генокоррекции онкологических заболеваний

Новые подходы к коррекции генных дефектов: Химеропластика (коррекция ДНК в клетке) Химеропласты - ДНК/РНК гибриды (около 25 нуклеотидов) шпилечной структуры с комплементарными мишени плечами. В гибрид вводится нужная нуклеотидная замена. В ядре клетки происходит гомологичная рекомбинация с исправлением дефекта последовательности. Успешная конверсия в 25-40% клеток.

Новые подходы к коррекции генных дефектов: «Exon-skipping» метод (метод выбрасывания экзона) Введение в клетку коротких антисмысловых последовательностей РНК, комплементарных местам сплайсинга первичного РНК- транскрипта. Проскальзывание петли сплайсинга, захват и выбрасывание из мРНК экзона, несущего мутацию.

Генная терапия пригодна для лечения широкого спектра заболеваний. Генная терапия имеет низкий уровень риска осложнений. Эффективность генной терапии на сегодняшний день близка к нулю. Выводы:

Сможет ли генная терапия в будущем обеспечить полноценную генокоррекцию, которая не представит угрозы для потомства? В какой мере полезность и необходимость генотерапевтической процедуры для индивидуума перевесят риск такого вмешательства для всего человечества? Сколь оправданы будут эти процедуры на фоне грядущего перенаселения планеты? Как будут соотноситься генно-инженерные мероприятия на человеке с проблемами гомеостаза общества и биосферы? Выводы: