Исследование тканеспецифичности энхансерной активности LTR HERV-K Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН Лаборатория структуры. - презентация

1 Исследование тканеспецифичности энхансерной активности LTR HERV-K Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН Лаборатория структуры и функции генов человека. Руководитель: к.б.н., с.н.с. Акопов С.Б.

2 Свойства ретровирусов §Вирионы ретровирусов окружены липопротеидной оболочкой. §Геном представлен двумя однонитевыми нефрагментированными молекулами РНК. §Репликация имеет две уникальные черты: а) с помощью вирус-специфичного фермента обратной транскиптазы осуществляется перевод РНК в ДНК форму, б) новосинтезированная ДНК интегрирует в геном инфицированной клетки.

3 U3 RU5 U3 RU5 gag pol env 8. Транспорт РНК 7. Процессинг РНК 6. Транскрипция LTR Cap (A) n Геномная РНК вируса Cap (A) n Сплайсированная РНК Белки 9. Трансляция 10.Сборка вируса 3. Освобождение РНК 4. Обратная транскрипция 5. Интеграция Вирус 11. Выход из клетки Вирус (вирусоподобная частица) 2. Проникновение в клетку 1. Взаимодействие с рецептором Схема жизненного цикла ретровирусов

4 Структура LTR

5 Образование одиночных LTR в геноме U3RU5 U3RU5 gag pol env LTR Рекомбинация Транскрипция Одиночный LTR

6 Потенциальная роль HERV в патогенезе §Индукция геномной нестабильности §Активация или инактивация генов, вовлечённых в регуляцию клеточного цикла §Продуцирование иммуносупреcсивных факторов §Изменение нормальной регуляторной функции HERV Scand. J. Immunol. 48, ,1998

7 Задачи §Наработать и проверить векторные конструкции. §Методом транзиентной экспрессии репортерного гена люциферазы измерить энхансерную активность полноразмерного и частично делетированного LTR в различных линиях клеток. §Статистически обработать полученные результаты. §Оценить тканеспецифичность экспрессии полноразмерного и частично делетированного LTR. §Сравнить активность полноразмерного и частично делетированного LTR в исследованных линиях клеток. Исследование тканеспецифичности энхансерной активности LTR HERV-K

8 Расположение LTR L47334 на хромосоме 19 человека Z N F Z N F Z N F ACUTE LYMPHOBLASTIC LEUKEMIA LYMPHOID LEUKEMIA LEUKEMIA HEMOLYTIC ANEMIA MALIGNANT HYPERTHERMIA MYOTONIC DYSTROPHY Pr1Pr2 33bp23bp 923bp

9 R Транскрипция TATAA AATAGGAGACTCCATTTTG AATAAA Участок связывания белков ERF и YY1 Промотор Сигнал полиаденилирования Структура LTR HERV-K U3U5 Негативный регулятор R TATAA AATAGGAGACTCCATTTTG AATAAA U3 Полноразмерный LTR LTR с делецией негативного регулятора

10 Схема исследования энхансерной активности LTR HERV-K с использованием системы экспрессии репортерного гена или Клонирование в репортерный вектор, лишенный энхансера. Трансфекция ДНК в клетки млекопитающих Измерение активности люциферазы ПЦР-амплификация LTR SV40 promoter pGLLTR Amp r f1 ori luc+ poly(A) signal poly(A) signal LTR BamH I

11 Использованные плазмиды

12

13 Контрольная плазмида

14

15

16 Результаты 293 CHO Tera1 NT2D1 NGP Jurkat HL-60 HeLa 293 CHO Tera1 NT2D1 NGP Jurkat HL-60 HeLa LTR U5del LTR LucPr SV 40 LTRLuc Pr SV 40

17 Результаты

18 293 CHO Tera1 NT2D1 NGP Jurkat HL-60 HeLa Энхансер SV-40 Luc Промотор SV CHO Tera1 NT2D1 NGP Jurkat HL-60 HeLa Luc Промотор SV 40 Промотор SV-40

19 Выводы §Показано наличие энхансерной активности LTR, принадлежащего семейству HERV-K (HML-2), в клеточной линии тератокарциномы Tera-1. §Обнаружена зависимость эффективности энхансера от клеточной линии, то есть его тканеспецифичность. §Показано, что активность энхансера SV40 для линий NT2/D1, Tera-1, HeLa, NGP-127, CHO-K1 значительно превышает активность в линиях Jurkat, HL-60, 293. §Показано, что делеция сайленсер-подобного элемента в U5 области LTR HERV-K не влияет на энхансерную активность этого LTR.