Актуальные вопросы детекции возбудителей заболеваний с фекально- оральным механизмом передачи ФГУН «ЦНИИ эпидемиологии» Роспотребнадзора Подколзин А.Т., Шипулин Г.А.

Особенности лабораторного мониторинга возбудителей заболеваний с фекально-оральным механизмом передачи Пациент Носитель Факторы передачи 1.Детекция 2.Типирование Восприимчивое звено

Вопросы для обсуждения 1. Детекция биопатогенов -Выбор технологии -Выбор инструмента 2. Оценка идентичности изолятов -Выбор метода 3. Типичные ошибки

Практическая доступность перспективных технологий детекции биопатогенов Next generation sequencing (высокопроизводительное секвенирование) Масс-спектрометрия (MALDI-TOF MS, IBIS Biosciences) Амплификационные биочипы (детекция биопатогенов) Point-of-care (РОС)-тесты (тесты у постели пациента) Иммунологические и неамплификационные биочипы Классическое секвенирование Real-time PCR

Критерии оптимального выбора инструмента 1. Наличие и адекватный ассортимент доступных диагностикумов 2. Экономическая целесообразность (стоимость приборов, расходных материалов, диагностикумов, обучения специалистов) 3. Открытость системы (потенциальная демонополизация поставок расходных материалов и диагностикумов) 4. Наличие адекватного сервисного обслуживания 5.Регистрация на территории РФ

Сопоставление себестоимости лабораторных методов детекции вирусных агентов ОКИ в РФ (2010г) Тест-системаСтоимость тест-системы Кол-во тестов Стоимость 1 иссл-я (RUR) Стоимость выявления 1 патогена (RUR) Amplified IDEIA Astrovirus (ПЦР)731 (EUR)96317,5 R Biopharm Norovirus (ИФА-АГ)696 (EUR)96302,3 Vegal Astrovirus (ИФА-АГ)135 (EUR)30187,7 DRG Adenovirus (ИФА-АГ)316,8 (EUR)96137,6 Savyon Rotavirus (иммунохроматография)3424 (RUR)25137,0 Savyon Adenovirus (иммунохроматография)3424 (RUR)25137,0 Seramun Astrovirus (ИФА-АГ)240 (EUR)96104,3 Vegal Rotavirus (ИФА-АГ)69 (EUR)3095,9 Seramun Rotavirus (ИФА-АГ)207 (EUR)9689,9 Амплисенс Rotavirus grA(ПЦР-форез + экстракция НК)3400 (RUR)5082,5 Вектор Бест Аденовирус (ИФА-АГ)7844 (RUR)9681,7 Вектор Бест Ротавирус (ИФА-АГ)7844 (RUR)9681,7 Savyon Rotavirus/Adenovirus (иммунохроматография)3712 (RUR)25148,574,2 Амплисенс Rotavirus grA/Astrovirus/Adenovirus grF (ПЦР-FL+ экстракция НК)8446 (RUR)50183,461,1 Savyon Rotavirus (ИФА-АГ)107 (EUR)9646,5 Аквапаст Ротавирус (ИФА-АГ)2100 (RUR)4843,8 Изоген Rotavirus (ПЦР-форез+ экстракция НК)4120 (RUR)10057,041,2 Амплисенс ОКИ скрин (ПЦР-FL+ экстракция НК)9744 (RUR)50209,429,9

Соответствие методов выявлении патогенов целям исследований (на примере ротавирусов гр А) Пациенты с манифестной инфекцией Пациенты с бессимптомной инфекцией Концентрированные образцы из окружающей среды Продукты питания Все методы (МАНК, ИФА-АГ, культуральные методы, иммунохроматография) МАНК, культуральные методы. ИФА-АГ, иммунохроматография - риск ложнонегативных результатов МАНК, культуральные методы. ИФА-АГ, иммунохроматография - неприменимы Культуральные методы? МАНК- риск ложнонегативных результатов. ИФА-АГ- неприменимы до Минимальная инфицирующая доза

Специализированные диагностические тесты для детекции биопатогенов в ООС Комплекты реагентов для детекции бактериальных патогенов в ООС -Амплисенс Shigella spp EIEC FL -Амплисенс EHEC O157H7 FL -Амплисенс Listeria monocytogenes FL -Амплисенс Salmonella spp FL -Амплисенс Campylobacter spp FL -Амплисенс Cronobacter (E sakazakii) FL этап культурального обогащения (проводится в соответствии с требованиями действующих ГОСТ и СП)

Основные требования к прикладным методам генетического типирования биопатогенов -Достаточная разрешающая (дифференцирующая) способность -Стабильность маркеров для эпидемиологических исследований - Воспроизводимость (этапов анализа, учета результатов и интерпретации)

Основные методы генетического типирования биопатогенов Вирусные агенты Бактериальные агенты Секвенирование вариабельных участков генома (отличаются от используемых в диагностических тест- системах) Могут использоваться без выделения чистой культуры Мультилокусное секвенирование- типирование (MLST) Требуют выделения чистой культуры - Риботипирование - Электрофорез в пульсирующем поле (PFGE) - Оценка полиморфизма длин фрагментов амплификации (AFLP) - Методики амплификации повторяющихся элементов переменной копийности (MLVA)

Методы генетического типирования

Стабильность маркеров для эпидемиологических исследований Кол-во изолятов S.Enteritidis из очага (n) Генотип характерный для очага Плазмидный тип (n) PFGE-тип (n) MLVA-тип (n) Очаг 5 (9) 1 (4) 2 (4) 3 (1) 2 (9)4 (9) Очаг 6 (3) 1 (5) 2 (3) 3 (3)6 (3) Очаг 1 (8) 1 (1) 6 (1) 5 (6) 1 (8)2 (8) Пример из практики Изоляты, выделенные в одном очаге различались по наличию низкомолекулярных плазмид. Низкомолекулярные плазмиды являются эпидемиологически нестабильным маркером что отражается в их потере или приобретении бактериальной клеткой из-за влияния факторов окружающей среды в короткий по эпидемиологическим меркам промежуток времени, в т.ч. в период формирования очага групповой заболеваемости или изоляции культур.

Типовые казусы (к вопросу о здравом смысле)

Примеры нецелевого использования диагностических инструментов зима 2010 – поиск ротавирусов в снегу (как потенциального источника поступления ротавирусов в реку, из которой проводится водозабор) РФ 2010 – плановое тестирование молочной продукции на содержание ротавирусов в период сезонного подъема заболеваемости РФ 2010 – применение ИФА-АГ для выявления ротавирусов в воде

Примеры нецелевого использования диагностических инструментов Псевдотипирование Нецелевое секвенирование Применение методов амплификации со случайными праймерами (RAPD – ПЦР) - внутрилабораторный уровень невоспроизводимости Попытки установить серотиповую принадлежность энтеровирусов (определяемую геном капсида – VP1) на основе секвенирования 5 UTR (мишень в диагностических тест-системах)

В качестве заключения… Лабораторные методы детекции биопатогенов в факторах передачи – важный, но ВСПОМОГАТЕЛЬНЫЙ инструмент в руках эпидемиолога. Принципы доказательной медицины успешно реализуются при использовании косвенных - статистических методов анализа эпидемиологических данных, доказывающих роль факторов передачи в развитии заболеваемости.

Благодарю за внимание! Контактная информация: «Референс-центр по мониторингу возбудителей острых кишечных инфекций» , Россия, г.Москва, ул. Новогиреевская, 3а +7(495)