Клеточные технологии в терапии гематологических заболеваний Академик РАМН, профессор А.Г.Румянцев, профессор А.А.Масчан, профессор С.А.Румянцев ФГБУ Федеральный научно-клинический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии им. Дмитрия Рогачева ГБОУ ВПО Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И.Пирогова XXVIII (91) Сессия общего собрания Российской академии медицинских наук «Клеточные технологии и регенеративная медицина» 4 – 5 июня 2013 Москва

Трансплантация гемопоэтических стволовых клеток: эволюция технологии Первые эксперименты ? Первый клинический опыт G.Mathe D.Thomas Первая успешная трансплантация 1968 R.Good Первые успешные трансплантации при острых лейкозах и приобретенной апластической анемии D.Thomas К 2013 году в мире выполнено более трансплантаций Ежегодно в мире выполняется около трансплантаций Плотность трансплантаций в западной Европе и США – на населения В России (потребность > 4000?)

Трансплантация – Паззл Пациент Возраст Сопутствующие болезни Инфекционный статус Биология болезни Чувствительность к химио и иммунотерапии Стадия Процедура трансплантации Режимы кондиционирования Профилактика РТПХ Стратегия контроля инфекций Донор сиблинг/неродственный/г аплоидентичный Возраст/инфекционный статус Трансплантат (источник истволовых клеток) Костный мозг Периферическая кровь Пуповинная кровь Генетика HLA Направленное изменение состава трансплантата

гг. У 641 пациента проведено 730 ТГСК возраст: 1 мес - 18 лет Трансплантация ГСК у детей: опыт ФНКЦ ДГОИ/РДКБ Виды ТГСК 1 - от HLA-идентичных родственных доноров 2 - неродственные 3 - аутологичные 4 - гаплоидентичные

Статус злокачественного заболевания на момент трансплантации Трансплантат Кондиционирование Профилактика РТПХ

Трансплантация от неродственного совместимого донора у детей: опыт ФНКЦ ДГОИ/РДКБ 1997 – 2011 год 148 пациентов 160 трансплантаций Медиана возраста 7,9 лет (0,5-18,7) М:Ж 98:48

ТРПХ оРТПХ 1-4 ст – 63% оРТПХ 2-4 ст – 42% оРТПХ 3-4 ст – 15% хрРТПХ - 39% хрРТПХ персистирует – 24%

Трансплантация от частично совместимых доноров: подходы к иммуномагнитному процессингу трансплантата

Трансплантации от альтернативного донора: за и против НеродственнаяПуповинная кровьГаплоидентичная Доступность20-70%90%100% Срок от начала поиска2-4 месяца1 месяц1 неделя Сложность организации+++ + Сложность процессинга+++++ Возможность посттрансплантационной иммунотерапии +-++ Опыт Гаплоидентичная трансплантация: новые технологии в клинике Новые методы иммуномагнитного процессинга: CD34+ селекция CD3+/CD19+ деплеция TCR альфа/бета деплеция Чистота продукта – 98% Потери ~ 20% Деплеция Т-лимфоцитов – 4.2 log Деплеция B-лимфоцитов – 3.5 log 2006 – – – – – – – 15

Состав трансплантата

Характеристики трансплантата

Трансплантация мезенхимальных стволовых клеток

Опыт клинического применения МСК в ФГУ ФНКЦ ДГОИ ( г.) Методика экспансии МСК оформлена в виде «новой медицинской технологии» и зарегистрирована Медицинская технология «Экспансия ex vivo мезенхимальных стволовых клеток» от 09 августа 2007 г. ФС-2007/176, выданная Федеральной службой по надзору в сфере здравоохранения и социального развития. МСК применялись: у 26 пациентов с РТПХ в дозе 2-4 млн клеток на кг веса 2-4 кратно. для ускорения приживления трансплантата у 16 пациентов в дозе 1-3 млн клеток на кг веса однократно за 2-4 часа до трансплантации кроветворных стволовых клеток. Выращивали МСК костного мозга пациентов используя стандартную методику клоногенного культивирования стромальных фибробластов костного мозга. Культивирование проводили до 2-3 пассажа.

Трансплантация NK-клеток

В ФГУ ФНКЦ ДГОИ разработана технология и проведена экспансия NK- клеток для клинического использования (18 образцов). Методика оформлена как новая медицинская технология. Материал - продукта афереза, либо продукт селекции CD56+ клеток из афереза периферической крови донора х 10 6 клеток. Способы культивирования закрытая система (пластиковые мешки для культивирования), открытая система (флаконы). Сроки экспансии – дней. Результат - более чем кратная экспансия CD56+ клеток Использование NK-клеток в дозах 5-10 млн на кг веса тела позволяет рассчитывать на улучшение исхода у пациентов с остаточными опухолями и после проведения трансплантации. Актуальность их применения растет с каждым годом в связи с широким применением трансплантаций гемопоэтических стволовых клеток, как одного из способов лечения ряда гематологических и онкологических заболеваний. NK-клетки - цитотоксические лимфоциты, обеспечивают эффект «трансплантат против опухоли», не вызывают РТПХ. фенотип: CD3-, CD16+,CD56+,CD94+. NK-клетки могут быть применены для иммунотерапии пациентов, клетки которых экспрессируют иные молекулы MHC класса I, что особенно актуально при гаплоидентичной трансплантации.

Использование дендритных вакцин

Экспансия дендритных клеток для приготовления противоопухолевых вакцин Опыт ФГБУ ФНКЦ ДГОИ: Создана персонифицированная технология лечения онкологических заболеваний. Отработаны методы индукции созревания и активации дендритных клеток с высоким уровнем антигенпрезентирующего потенциала при культивировании in vitro с ростовыми факторами и опухолевым лизатом. Разработаны методы оценки противоопухолевого ответа у вакцинированных больных. Создан банк хранения опухолевого материала.

Технология ex vivo экспансии лимфокин-активированных лимфоцитов

Лимфокин-активированные киллеры (ЛАК) представляют собой генерируемые из мононуклеарных лейкоцитов при инкубации с интерлейкином-2 (ИЛ-2) активированные лимфоциты. ЛАК, характеризуются высокой НК-активностью и обладают цитотоксическим действием по отношению к аутологичным и аллогенным опухолевым клеткам. Подобно натуральным киллерам (НК), оказывают избирательное действие на трансформированные клетки, вызывая лизис опухолевых клеток-мишеней, и не влияют на нормальные клетки организма. Антиген-специфическая Т-клеточная терапия применяется при лечении: Гемобластозов (ОМЛ,ОЛЛ,ХМЛ, НХЛ) Солидных опухолей (рабдомиосаркома, опухоль Вильмса и др.) Лечение осложнений после проведения высокодозной химиотерапии и ТКМ (ЭБВ- лимфопролиферативные заболевания)

Трансплантация стволовых клеток пуповиной крови

Банки пуповинной крови 1993 год - New York, Milan, Dűsseldorf 2003 год - Bone Marrow Donor Worldwide (33 банка ПК из 21 страны) 2003 год – открытие БСК ДЗ г.Москвы 2005 год – открытие Центра крови в г. Самаре На публичном хранении 6656 образцов, 42 выдано для трансплантации (из них 12 за рубеж), 1550 на персональном хранении

МЕТОД УМЕНЬШЕНИЯ ОБЪЕМА до 25 ml до 25 ml t Усиление осаждения RBC с применением HES t Центрифугирование и удаление избытка эритроцитов и плазмы для получения 20 мл концентрата WBC t Криопротектант с конечной концентрацией 0.8 % HES, 1 % Dextran 40, 10 % DMSO в окончательном объеме 25 мл Процессинг в банке ПК

Особенности кроветворения новорожденного ребенка Высокая проницаемость Особенности костномозгового барьера иммунитета Мобилизующий эффект цитокинов, запускающих роды Большое количество коммитированных (в основном за счет CFU-GM и CFU-GEMM) и более ранних клеток- предшественников, обладающих высокой пролиферативной активностью.

Колониеобразующую активность лейкоцитарной фракции ПК определяли при культивировании в течение 14 суток в метилцеллюлозе (готовая среда, содержащая факторы роста «MethoCult 4338, StemCellTehnologies, Canada) с подсчетом количества КОЕ-ГЭММ, КОЕ-ГМ, КОЕ-Г, КОЕ-М, КОЕ-Э. CD34+клетки Спектр гемопоэтических клеток- предшественников пуповинной крови Количество CD34+клеток в ПК доношенных новорожденных CD34+клетки (%) – 0,827 CD34+клетки (10³/мм³) Состав пуповинной крови (n=1004)

Влияние родового стресса на выраженность мобилизации ПК Пол новорожденного Масса тела новорожденного Способ родоразрешенияОстрая гипоксия плода

Источники стволовых клеток Костный мозг Периферическая кровь Пуповинная кровь

G0G0 G 2 /S Г-КСФ IL-8 IL-8 MMP-9 Кровь К.М. нейтрофил моноцит

G 2 /S G0G0 Г-КСФ Кровь К.М. IL-8 IL-8 MMP-9

Strategy to separate CXCR4 + HSC from CXCR4 + TCSC Medium aloneSDF-1 Chemotaxis to SDF-1 FACS SORTER CD45 - CD45 + Bone Marrow Mononuclear Cells CXCR4 + CD45 - CXCR4 + CD45 +

Strategy to separate CXCR4 + HSC from CXCR4 + TCSC CXCR4 + CD45 + CXCR4 + CD45 - in vitro - CFU-GM In vivo - CFU-S Evaluation of hematopoietic potential of sorted cells Biol Cell 2005, 97,

Blood 2002, 100, 515 Stem Cells 2003, 21: Leukemia 2004, 18: Circulation 2004, 110: Circulation Res. 2004, 95:1191-9

Patel and Rameshwar. Curr Pharmacogenomics Person Med September 1; 9(3): 229–239.

37 Доказательства межклеточных взаимодействий в системе мать-плод При всех беременностях человека клетки плода встраиваются в циркуляцию матери Клетки плода обнаруживаются на 6 неделе гестации и частота их обнаружения нарастает с ростом гестационного возраста, достигая 100% к 36 неделе гестации При нормальной беременности во втором триместре беременности число клеток плода в венозной крови матери составляет 1-6 клеток/мл (т.е., от 5 до 30х10 3 клеток) При аномалиях плаценты и плода, эклампсии, проблемах тканевой совместимости, невынашивании, самопроизвольных абортах в сроки от 20и недель, число циркулирующих клеток плода возрастает до клеток в мл. После родов количество клеток плода в циркуляции резко снижается, но 50% фетальных клеток обнаруживаются в крови от 4 недель до 10 недель после родов Специальные исследования послеродового микрохимеризма обнаруживают его у 40% здоровых женщин, перенесших беременность

38 Определение фетальной ДНК и РНК в материнской плазме 1997 г. Определение Y хромосомы для диагностики пола плода и косвенно генной патологии, связанной с полом плода 1998 г. Определение RhD + плода у RhD – матери и в дальнейшем других редких групп крови плода гг. Неинвазивная пренатальная диагностика: Гомозиготная β-талассемия Гомозиготная β-талассемия Гемоглобинопатии (HbE и др.) Гемоглобинопатии (HbE и др.) Муковисцидоз Муковисцидоз Ахондроплазия Ахондроплазия Болезнь Дауна Болезнь Дауна Болезнь Хантингтона Болезнь Хантингтона Врожденная гиперплазия надпочечников Врожденная гиперплазия надпочечников Врожденная миодистрофия и др. Врожденная миодистрофия и др.

МАТЕРИНСКИЙ МИКРОХИМЕРИЗМ И НЕОНАТАЛЬНЫЙ ИММУНИТЕТ Поступление материнских клеток в плод документировано 53 года назад (Grenn I. et al, Hodgkins disease: a maternal-to fetal lymphocyte chimera? Lancet, 1960) Материнская ДНК определяется у плода с момента развития плацентарного кровообращения. Панель для РТ-ПСР, информативна для 90% пар ребенок-мать с чувствительностью1:10 6 разработана 8 лет назад (Lambert NC et al. Arthritis Rheum, 2004, 50, ) и протестирована на 47 клеточных линиях Диагностика/скрининг – пуповинная кровь Доказан перенос клеток с материнским молоком Изучен клеточный состав ММХ: макрофаги, Т-клетки, В-клетки, естественные киллеры Имеются описания переноса опухолевых заболеваний (НХЛ, меланома и др.) Материнские клетки обнаружены у детей не только в виде циркулирующих в крови клеток, но и как дифференцированные тканевые клетки кожи, тимуса, сердца, легких, поджелудочной железы, селезенки, почки, мышц и костного мозга

НОВЫЙ КОНЦЕПТ Каждый ребенок представляет собой мультихимерный организм, построенный из клеток не только многих индивидов, но и многих поколений ИДС сопровождаются активным ММХ, приживлением клеток и возникновением РХПТ и/или РТПХ. ММХ – один из механизмов, объясняющих аутоиммунные расстройства при ИДС

Трансмиссия вирус-инфицированных лимфоцитов (Berencsi, 2012) Трансмиссия клеток с предзлокачественными изменениями: необходимость второго удара (second hit) для злокачественной трансформации (Berencsi, Barcsay, 2012) Изменение иммунного надзора: Материнские микрохимеризм обнаруживается у 1/3 женщин в клетках, участвующих в осуществлении функций врожденного и адаптивного иммунитета (Т- и В-лимфоциты, НК-клетки, макрофаги) Lab investigation, 2006 Возможный вклад микрохимеризма в онкогенез

Sharkis et al. Sci Transl Med March 28; 4(127): Перспективы использования iPSCs

Спасибо за внимание!