Введение в кристаллографию макромолекул Лекция 3 Владимир Юрьевич ЛУНИН Институт Математических Проблем Биологии РАН Пущино

Вычисление коэффициентов ряда Фурье Любая функция на отрезке [0,1] может быть разложена, при этом единственным образом, в ряд Фурье.

модуль и фаза коэффициентов Фурье, отвечающих частоте h -

Ряды Фурье для функций нескольких переменных

Вклады в амплитуду и фазу рассеянной волны, зависят от распределения электронной плотности в элементарной ячейке и могут быть рассчитаны по формулам h,k,l - целые Рентгеновский эксперимент с монокристаллом позволяет измерить интенсивность волн, рассеянных в направлениях, определяемых условиями

1. Рентгеновский дифракционный эксперимент с эксперимент с монокристаллом позволяет измерить модули коэффициентов в разложении функции распределения электронной плотности в ряд Фурье. 2. Знание значений модулей и фаз дает возможность рассчитать "синтез Фурье электронной плотности" 3. Наличие модели структуры дает возможность рассчитать гипотетические значения модулей и фаз и сравнить модули с экспериментальными значениями

Подходы к решению фазовой проблемы SIR - Single Isomorphous Replacement Однократное изоморфное замещение; MIR - Multiple Isomorthous Replacement Множественное изоморфное замещение; AD -Anomalous Dispersion Аномальное рассеяние; MAD - Multiwavelength Anomalous Diffraction Многоволновое аномальное рассеяние; MR - Molecular Replacement Молекулярное замещение; Direct Methods (ab initio methods) "Прямые" методы.

Подходы к решению фазовой проблемы SIR - Single Isomorphous Replacement Однократное изоморфное замещение; {FP}{FP} {F PH } { P } "нативный" белок изоморфное производное

метод позволяет решать фазовую проблему; наличие каналов в кристаллах белка позволяет получать производные; изоморфизм имеет место лишь приближенно; проблема определения мест присоединения тяжелых меток; проблема создания тяжелых меток для больших макромолекулярных комплексов фазы определяются неоднозначно; необходимо несколько производных. MIR - Multiple Isomorthous Replacement Множественное изоморфное замещение;

AD -Anomalous Dispersion Аномальное рассеяние Из кинематической теории рассеяния следует, что (закон Фриделя). При наличии аномально рассеивающих атомов (а.р.а.) закон нарушается. Измерения F(-s) и F(s) становятся независимыми. Их сравнение позволяет решать фазовую проблему. метод позволяет решать фазовую проблему; в белках встречаются а.р.а.; можно использовать производные с тяжелыми атомами; проблема определения мест нахождения аномально рассеивающих атомов; фазы определяются неоднозначно;

MAD - Multiwavelength Anomalous Diffraction Многоволновое аномальное рассеяние; В основе подхода лежит изменение интенсивности аномального рассеяния при изменении длины волны. один из активно используемых методов решения фазовой проблемы; возможность использования селен-метиониновых производных; проблема определения мест нахождения аномально рассеивающих атомов; не всегда получается. Methionin C S N O Se

Синтез Фурье электронной плотности для белка альдоз-редуктазы. Разрешение 0.9Å. Фазы определены методом MAD.

MR - Molecular Replacement Молекулярное замещение;

Комбинированные синтезы Фурье модель структурные факторы Синтез Фурье ? ?

Комбинированные синтезы Фурье модель структурные факторы Синтез Фурье /2

Комбинированные синтезы Фурье модельструктурные факторы Синтез Фурье /2 - +

MR - Molecular Replacement Молекулярное замещение; План действий: А. Найти в банке белок с известными координатами (пробную модель), чья структура ожидается быть похожей на структуру исследуемого белка. Б. Разместить пробную модель в элементарной ячейке так, чтобы получить максимальное соответствие этой модели исследуемой структуре. В. Рассчитать по оптимально размещенной пробной модели значения фаз структурных факторов.

MR - Molecular Replacement Молекулярное замещение; ? В общем случае положение твердого тела определяется шестью параметрами (,,, t x, t y, t z ). пробная модель углы вращениявектор трансляции

MR - Molecular Replacement Молекулярное замещение; Для каждого допустимого набора параметров (,,, t x, t y, t z ) можно рассчитать соответствующие значения модулей структурных факторов Хотим иметь наилучшее совпадение с экспериментально определенными модулями Оптимальное размещение пробной модели Задачу можно разделить на два этапа: поиск углов вращения ("функция вращения") и поиск трансляции ("функция трансляции").

MR - Molecular Replacement Молекулярное замещение; С нахождением оптимальной ориентации и положения пробной модели работа не кончается! Надо откорректировать модель.

MR - Molecular Replacement Молекулярное замещение; один из наиболее используемых методов решения фазовой проблемы; чем больше белков исследовано, тем шире возможности метода; необходимо наличие гомологичной пробной модели; результат зависит от обоснованности гипотезы о гомологии между пробной моделью и исследуемой структурой.

MR - Molecular Replacement Молекулярное замещение; Где взять гомологичную пробную модель? среди структур, определенных РСА; среди структур определенных ЯМР; электронная микроскопия; теоретическое предсказание модели.

"Прямые" методы Основаны на информации общего типа: атомность; неотрицательность функции распределения электронной плотности; разделенность атомов в пространстве; связность областей высокой электронной плотности; гистограммы синтезов Фурье. Низкомолекулярные структуры - рутинное использование; Небольшие белки, высокое разрешение - ряд успешных попыток; Большие комплексы, среднее разрешение - в процессе разработки, отдельные успешные попытки.

Модель структуры ATOM 30 N SER Y X Z абсолютные координаты (X,Y,Z) Ортогональная система координат, единица измерения Å. a b c относительные координаты (x,y,z): r=xa + yb +zc CRYST SCALE SCALE SCALE xfrac = S11X + S12Y + S13Z + U1 yfrac = S21X + S22Y + S23Z + U2 zfrac = S31X + S32Y + S33Z + U3 S U

Температурный фактор (temperature factor / Atomic Displacement Parameter / ADP) (e/Å 3 ) r (Å)

Радиальное распределение электронной плотности в атоме углерода при разных значениях температурного фактора B. (e/Å 3 ) r (Å)

Радиальное распределение электронной плотности в атоме углерода при разных значениях температурного фактора B. (e/Å 3 ) r (Å)

Радиальное распределение электронной плотности в атоме углерода при разных значениях температурного фактора B. (e/Å 3 ) r (Å)

Радиальное распределение электронной плотности в атоме углерода при разных значениях температурного фактора B. (e/Å 3 ) r (Å)

Радиальное распределение электронной плотности в атоме углерода при разных значениях температурного фактора B. (e/Å 3 ) r (Å)

Радиальное распределение электронной плотности в атоме углерода при разных значениях температурного фактора B. (e/Å 3 ) r (Å)

Радиальное распределение электронной плотности в атоме углерода при разных значениях температурного фактора B. (e/Å 3 ) r (Å)

Радиальное распределение электронной плотности в атоме углерода при разных значениях температурного фактора B. (e/Å 3 ) r (Å) u - смещение атома

Радиальное распределение электронной плотности в атоме углерода при разных значениях температурного фактора B. (e/Å 3 ) r (Å) u - смещение атома B

Радиальное распределение электронной плотности в атоме углерода при разных значениях температурного фактора B. (e/Å 3 ) r (Å) u - смещение атома B

ATOM 30 N SER Изотропный температурный фактор

Анизотропный температурный фактор ATOM 30 N SER ANISOU 30 N SER

Коэффициент заполнения / заселенность / occupancy Идеальный кристалл - содержимое всех элементарных ячеек идентично.

Коэффициент заполнения / заселенность / occupancy "Реальный" кристалл - молекула "воды" присутствует только в 73% элементарных ячеек.

Коэффициент заполнения / заселенность / occupancy ATOM 6626 O HOH X Y Z T B Для данных координат атома коэффициент заполнения показывает какой процент элементарных ячеек кристалла содержат атом в указанной позиции.

Коэффициент заполнения / заселенность / occupancy Альтернативные конформации ATOM 5490 N ATRP ATOM 5514 N BTRP

Уточнение параметров модели - параметры модели - рассчитанные по модели модули структурных факторов - экспериментально определенные модули структурных факторов Хотим иметь Получили задачу на минимизацию (нелинейный "метод наименьших квадратов" / least squares / LSQ).

Типичная задача: endonuclease Sm Число неводородных атомов Число независимых параметров Число независимых ограничений (1.1Ǻ set) Проблемы: много локальных максимумов; возможно только локальное уточнение; радиус сходимости ~ 0.7Å; модель "рассыпается". Стандартный фактор достоверности / R-factor

Стереохимические ограничения - параметры модели - расстояние между i-ым и j-ым атомами в модели - идеальное расстояние между i-ым и j-ым атомами в модели 1.46Å 1.37Å 1.24Å 1.52Å1.02Å Хотим иметь

Стереохимические ограничения - параметры модели - расстояние между i -ым и j -ым атомами в модели - идеальное расстояние между i -ым и j -ым атомами в модели 1.46Å 1.37Å 1.24Å 1.52Å1.02Å Хотим иметь

Составной критерий А как выбрать веса w X-ray, w dist ?

Стереохимические ограничения - параметры модели - угол между i,j,k -ыми атомами в модели - идеальный угол между i,j,k - ыми атомами в модели Хотим иметь

Двугранные углы

Плоские группы

Хиральность

R-free все рефлексы рабочие контрольные уточнение модели только контроль R-free

Вода, водороды.

Частичная модель"Потерянные" атомы Подгонка F calc,part к F obs может сдвигать координаты атомов с их правильных значений. Обычное уточнение

Максимизация правдоподобия Likelihood-based refinement raw (partial) model { r j } randomly added solvent atoms { u k } calculated magnitudes for mixed (real and imaginary atoms) model F h calc ({ r j }+{ u k })= |F h part ({ r j })+ F h sol ({ u k })| F h obs L({ r j })= Probability{F h calc ({ r j }+{ u k })=F h obs for all h } maximum Likelihood-based refinement F h part ({ r j }) F h sol ({ u j })

Pyrobaculum aerophilum A pilot project in structural genomics A test case to find the bottlenecks: summary of results from all laboratories in the project Step Cloned Expressed in E. coli Purified Crystallized X-ray structures NMR structures Number of genes Next: how to increase the success rate? T.Terwilliger ?

h k l F σ crystal Intensities I s of diffracted beams X-ray experiment X-ray source registration Kinematic theory of diffraction X-ray structure analysis

h k l F σ X Y Z T B ATOM 6 CA MET A ATOM 7 C MET A ATOM 8 O MET A ATOM 9 CB THR A ATOM 10 OG1 THR A ATOM 11 CG2 THR A Protein Data Bank The phase problem preliminary model refined model The solving of the structure ={r: S (r) > }

1. Дж.Гласкер, К.Трублад. Анализ кристаллической структуры. "Мир", Москва, М.А.Порай-Кошиц. Основы структурного анализа химических соединений. Москва, "Высшая школа", Т.Бландел, Л.Джонсон. Кристаллография белка. "Мир", Москва, Ч.Кантор, П.Шиммел. Биофизическая химия, том 2. Москва, "Мир", International Tables for Crystallography, vol. F. Crystallography of biological macromolecules. by Kluwer Academic Publishers, Dordrecht/Boston/London, 2001

X-RAY CRYSTALLOGRAPHY From : Nobel Prizes for X-Ray science. Published by the Advanced Photon Source at Argonne National Laboratory on the occasion of the Centennial Meeting of the American Physical Society. «A Century of Physics», March 20-26, 1999