Х РОМОСОМНЫЙ И ГЕНОМНЫЙ УРОВНИ ОРГАНИЗАЦИИ НАСЛЕДСТВЕННОГО МАТЕРИАЛА Красноярский государственный медицинский университет им. В.Ф. Войно-Ясенецкого Кафедра Биологии с экологией и курсом фармакогнозии Лекция 5 для специальности – «Медицинская кибернетика» (очная форма обучения) д.б.н. Орлянская Т.Я. к.б.н. Ермакова И.Г. Красноярск 2013

План лекции: 1.История открытия хромосом 2.Хромосомная теория наследственности 3.Строение хромосом 4.Кариотип 5.Хромосомное определение пола 6.Геномный уровень организации наследственной информации

Хромосомы нуклеопротеидные структуры в ядре эукариотической клетки, становятся легко заметными во время митоза или мейоза. Хромосомы представляют собой высокую степень конденсации хроматина, постоянно присутствующего в клеточном ядре.

И СТОРИЯ ОТКРЫТИЯ ХРОМОСОМ В разных статьях и книгах приоритет открытия хромосом отдают разным людям, но чаще всего годом открытия хромосом называют 1882 год, а их первооткрывателем немецкого анатома В.Флеминга. Однако справедливее было бы сказать, что он не открыл хромосомы, а в своей фундаментальной книге «Zellsubstanz, Kern und Zelltheilung» собрал и упорядочил сведения о них, дополнив результатами собственных исследований.

Термин «хромосома» был предложен немецким гистологом Генрихом Вальдейером в 1888 году. «Хромосома» в буквальном переводе означает «окрашенное тело».

После переоткрытия в 1900 году законов Менделя потребовалось всего один-два года для того, чтобы стало ясно, что хромосомы ведут себя именно так, как это ожидалось от "частиц наследственности". Т. Бовери и У.Сэттон (1902 – 1907 гг.) независимо друг от друга первыми выдвинули гипотезу о генетической роли хромосом.

Вильсон (1905 – 1906 гг.) открыл половые хромосомы Экспериментальное подтверждение этих идей и окончательное формулирование хромосомной теории было сделано в первой четверти XX века основателями классической генетики, Т.Морганом, К.Бриджесом, А.Стёртевантом и Г.Мёллером, работавшими в США с плодовой мушкой ( D.melanogaster ).

Т. Морган и его сотрудники в 1910 г. открыли сцепленное наследование и доказали, что хромосома состоит из генов, расположенных в линейном порядке. Они сформулировали хромосомную теорию наследственности и доказали роль хромосом в определении пола. Эти выводы были опубликованы в 1915 году в книге «The mechanisms of mendelian heredity» (механизмы менделевской наследственности). В 1933 году за открытие роли хромосом в наследственности Т.Морган получил Нобелевскую премию по физиологии и медицине.

Х РОМОСОМНАЯ ТЕОРИЯ НАСЛЕДСТВЕННОСТИ Около 61 % известных человеческих заболеваний имеют узнаваемое соответствие в генетическом коде плодовой мушки, 50 % белковых последовательностей имеют аналоги у млекопитающих. Дрозофилы используются в генетическом моделировании некоторых человеческих заболеваний, включая болезни Паркинсона и Альцгеймера. Мушка также часто используется для изучения механизмов, лежащих в основе иммунитета, диабета, рака и наркотической зависимости.

Хромосомные наборы (2n) самки и самца дрозофилы Геном дрозофилы меланогастер содержит 4 пары хромосом: X/Y пара и три аутосомы, маркируемых как 2, 3 и 4. Геном состоит из порядка 132 миллионов оснований и приблизительно генов. В настоящее время геном дрозофилы полностью секвенирован и аннотирован. Секвенирование биополимеров (белков и нуклеинов ых кислот ДНК и РНК) определение их первичной аминокислотной или нуклеотидной последовательности.

О СНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ ХРОМОСОМНОЙ ТЕОРИИ Хромосома состоит из генов Каждый ген занимает определённое место- локус Гены располагаются в хромосоме в линейном порядке Гены, расположенные в одной хромосоме, сцеплены между собой, образуют группу сцепления и наследуются вместе У каждого вида организмов число групп сцепления равна числу пар хромосом. Сцепление может быть полным (абсолютным) и не полным (не абсолютным). Сила сцепления между генами в хромосоме обратно пропорциональна расстоянию между ними.

Х = кросс. особей n х 100 Нарушение сцепления генов в хромосоме возникает в результате кроссинговера Частота возникновения кроссинговера между генами прямо пропорциональна расстоянию между ними, а сила сцепления – обратно пропорциональна Расстояние между генами определяется по формуле: выражается в процентах кроссинговера или в морганидах

Явление кроссинговера доказывает, что хромосома, с одной стороны, дискретная структура, а с другой – целостная. Таким образом, в хромосомной теории нашел отражение принцип генетики – единство дискретности и непрерывности наследственного материала.

С УТЬ ХРОМОСОМНОЙ ТЕОРИИ НАСЛЕДСТВЕННОСТИ : Хромосома является материальным носителем наследственной информации

Основу хромосомы составляет линейная макромолекула ДНК. В растянутом виде длина хромосомы человека может достигать 5 см. В молекулах ДНК хромосом человека насчитывается от 50 до 245 миллионов пар азотистых оснований. Помимо неё, в состав хромосомы входят пять специализированных белков H1, H2A, H2B, H3 и H4 гистонгов и ряд негистоновых белков. Последовательность аминокислот гистонов высококонсервативна и практически не различается в самых разных группах организмов.

В интерфазе хроматин не конденсирован. Его нити представляют собой комплекс из ДНК и белков. Макромолекула ДНК обвивает октамеры (структуры, состоящие из восьми белковых глобул) гистоновых белков H2A, H2B, H3 и H4, образуя нуклеосомы. Последовательность из таких нуклеосом, соединённых белком H1, называется нуклеофиламентом, или нуклеосомной нитью, диаметром около 10 нм. В ранней интерфазе ( фаза G 1 ) основу каждой из будущих хромосом составляет одна молекула ДНК. В фазе синтеза ( S ) молекулы ДНК вступают в процесс репликации и удваиваются. В поздней интерфазе ( фаза G 2 ) основа каждой из хромосом состоит из двух идентичных молекул ДНК, образовавшихся в результате репликации и соединённых между собой в районе центромерной последовательности.

Перед началом деления клеточного ядра хромосома, представленная на этот момент цепочкой нуклеосом, начинает спирализовываться, или упаковываться, образуя при помощи белка H1 более толстую хроматиновую нить, или хроматиду, диаметром 30 нм. В результате дальнейшей спирализации диаметр хроматиды достигает ко времени метафазы 700 нм. Значительная толщина хромосомы ( диаметр 1400 нм ) на стадии метафазы позволяет, наконец, увидеть её в световой микроскоп. Конденсированная хромосома имеет вид буквы X (часто с неравными плечами), поскольку две хроматиды, возникшие в результате репликации, по- прежнему соединены между собой в районе центромеры первичной перетяжкой.

НитьДНК Нуклеосомный уровень Уровень 30 нм фибрилл Метафазная хромосома Активная хромосома Схема конденсации хроматина

Т ИПЫ СТРОЕНИЯ ХРОМОСОМ Различают четыре типа строения хромосом: телоцентрические (палочковидные хромосомы с центромерой, расположенной на проксимальном конце); акроцентрические (палочковидные хромосомы с очень коротким, почти незаметным вторым плечом); субметацентрические (с плечами неравной длины, напоминающие по форме букву L); метацентрические (V-образные хромосомы, обладающие плечами равной длины). Тип хромосом является постоянным для каждой гомологичной хромосомы у всех представителей одного вида или рода.

Первичная перетяжка делит хромосому на плечи. Вторичные перетяжки – морфологический признак, позволяющий идентифицировать отдельные хромосомы в наборе. От первичной перетяжки отличаются отсутствием заметного угла между сегментами хромосомы. Вторичные перетяжки бывают короткими и длинными и локализуются в разных точках по длине хромосомы. У человека это 9, 13, 14, 15, 21 и 22 хромосомы.

Спутники (сателлиты) Сателлит это округлое или удлинённое тельце, отделённое от основной части хромосомы тонкой хроматиновой нитью, по диаметру равный или несколько меньший хромосоме. Хромосомы, обладающие спутником принято обозначать SAT-хромосомами. Форма, величина спутника и связывающей его нити постоянны для каждой хромосомы.

Зона ядрышка Зоны ядрышка ( организаторы ядрышка ) специальные участки, с которыми связано появление некоторых вторичных перетяжек. Хромонема Хромонема это спиральная структура, которую удаётся увидеть в декомпактизованных хромосомах через электронный микроскоп. Хромонема может состоять из двух, четырёх и более нитей, в зависимости от исследуемого объекта.

Концевые участки хромосом получили название теломеры. Теломерные участки хромосом характеризуются отсутствием способности к соединению с другими хромосомами или их фрагментами и выполняют защитную функцию. Окрашенные хромосомы человека (синие) и их теломеры (белые) Схема расположения теломер на хромосоме

У большинства эукариот теломеры состоят из специализированной линейной хромосомной ДНК, состоящей из коротких тандемных повторов. Теломерные повторы весьма консервативные последовательности, например повторы всех позвоночных состоят из шести нуклеотидов TTAGGG, повторы всех насекомых TTAGG, повторы большинства растений TTTAGGG. Ученые из университета Кардиффа установили, что критическая длина человеческой теломеры, при которой хромосомы начинают соединяться друг с другом, составляет 12,8 теломерных повторов.

В каждом цикле деления теломеры клетки укорачиваются из-за неспособности ДНК- полимеразы синтезировать копию ДНК с самого конца. Она в состоянии лишь добавлять нуклеотиды к уже существующей 3-гидроксильной группе. По этой причине ДНК-полимераза нуждается в праймере, к которому она могла бы добавить первый нуклеотид. Это явление называется концевая недорепликация и является одним из важнейших факторов биологического старения.

Существует специальный фермент теломераза, который при помощи собственной РНК-матрицы достраивает теломерные повторы и удлиняет теломеры. В большинстве дифференцированных клеток теломераза заблокирована, однако активна в стволовых и половых клетках. За открытие защитных механизмов хромосом от концевой недорепликации с помощью теломер и теломеразы в 2009 году присуждена Нобелевская премия по физиологии и медицине австралийке, работающей в США, Элизабет Блекберн, американцам Кэрол Грейдер и Джеку Шостаку.

Теоретически теломеры должны укорачиваться весьма медленно по несколько (3–6) нуклеотидов за клеточный цикл, т.е. за количество делений, соответствующее пределу Хейфлика, они укоротятся всего на 150–300 нуклеотидов. Предел или лимит Хейфлика граница количества делений соматических клеток. Клетки человека, делящиеся в клеточной культуре, умирают приблизительно после 50 делений и проявляют признаки старения при приближении к этой границе.

В настоящее время предложена эпигенетическая теория старения, которая предполагает, что эрозия теломер ускоряется в десятки и сотни раз из-за рекомбинаций в их ДНК, вызванных функционированием клеточных систем репарации ДНК. Активность данных систем инициируется повреждением ДНК, обусловленном прежде всего дерепрессирующимися с возрастом мобильными элементами генома, что и предопределяет старение как биологический феномен Дерепрессия – индукция транскрипции гена в результате подавления функций репрессора, нарушения его связи с операторной зоной оперона под действием индуктора, мутаций и т.п..

Кариотип совокупность признаков (число, размеры, форма и т. д.) полного набора хромосом, присущая клеткам данного биологического вида ( видовой кариотип ), данного организма ( индивидуальный кариотип ) или линии (клона) клеток. Кариотипом иногда также называют и визуальное представление полного хромосомного набора ( кариограммы ).

Изображение набора хромосом (справа) и систематизированный женский кариотип 46 XX (слева).

К АК ОПРЕДЕЛЯЮТ КАРИОТИП ? Для процедуры определения кариотипа могут быть использованы любые популяции делящихся клеток. Для определения человеческого кариотипа используют, как правило, лимфоциты периферической крови, переход которых от стадии покоя G 0 к пролиферации провоцируют добавлением митогена фитогемагглютинина. Для определения кариотипа могут быть использованы также клетки костного мозга или первичная культура фибробластов кожи.

Для увеличения числа клеток на стадии метафазы к культуре клеток незадолго перед фиксацией добавляют вещества (например, колхицин), которые блокируют образование микротрубочек, тем самым препятствуя расхождению хроматид к полюсам деления клетки и завершению митоза. После фиксации препараты метафазных хромосом окрашивают и фотографируют;

Из микрофотографий формируют так называемый систематизированный кариотип нумерованный набор пар гомологичных хромосом, изображения хромосом при этом ориентируются вертикально короткими плечами вверх, их нумерация производится в порядке убывания размеров, пара половых хромосом помещается в конец набора. Наиболее часто используемой методикой в медицинской генетике является метод G- дифференциального окрашивания хромосом

Для получения классического кариотипа используется окраска хромосом различными красителями или их смесями. в силу различий в связывании красителя с различными участками хромосом окрашивание происходит неравномерно и образуется характерная полосчатая структура, отражающая линейную неоднородность хромосомы и специфичная для гомологичных пар хромосом и их участков. Первый метод окраски хромосом, позволяющий получить такие высокодетализированные изображения, был разработан шведским цитологом Касперссоном ( Q-окрашивание ).

М ЕТОДИКИ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОГО ОКРАШИВАНИЯ ХРОМОСОМ Q-окрашивание окрашивание по Касперссону акрихин-ипритом с исследованием под флуоресцентным микроскопом. G-окрашивание модифицированное окрашивание по Романовскому Гимзе. R-окрашивание используется акридиновый оранжевый и подобные красители, при этом окрашиваются участки хромосом, нечувствительные к G-окрашиванию. C-окрашивание применяется для анализа центромерных районов хромосом. T-окрашивание применяют для анализа теломерных районов хромосом.

Х РОМОСОМЫ ЧЕЛОВЕКА Различные виды дифференциальной окраски: С- окраска R- окраска Рутинная окраска по Романовскому Гимзе

В последнее время используется методика спектрального кариотипирования, состоящая в окрашивании хромосом набором флуоресцентных красителей, связывающихся со специфическими областями хромосом.

В результате такого окрашивания гомологичные пары хромосом приобретают идентичные спектральные характеристики Это не только существенно облегчает выявление таких пар, но и облегчает обнаружение межхромосомных транслокаций транслоцированные участки имеют спектр, отличающийся от спектра остальной хромосомы.

Изображение набора хромосом (справа) и систематизированный женский кариотип 46 XX (слева). Получено методом спектрального кариотипирования.

А НАЛИЗ КАРИОТИПОВ Сравнение комплексов поперечных меток в классической кариотипии или участков со специфичными спектральными характеристиками позволяет детально определять хромосомные аберрации внутри- и межхромосомные перестройки, которые сопровождаются нарушением порядка фрагментов хромосом делеции, дупликации, инверсии, транслокации. Такой анализ имеет большое значение в медицинской практике, позволяя диагностировать ряд хромосомных заболеваний, вызванных как нарушениями числа хромосом, так и нарушением хромосомной структуры.

Делеция – утрата участка хромосомы Инверсия - изменение порядка генов участка хромосомы на обратный Дупликация - повторение участка хромосомы

Транслокация - перенос участка хромосомы на другую Изохромосомы - несущие два одинаковых плеча.

КариотипыБолезньКомментарий 47,XXY; 48,XXXY;Синдром КлайнфельтераПолисомия по X-хромосоме у мужчин 45X0; 45X0/46XX; 45,X/46,XY; 46,X iso (Xq) Синдром Шерешевского Тёрнера Моносомия по X хромосоме, в том числе и мозаицизм 47,ХХX; 48,ХХХХ; 49,ХХХХХ Полисомии по X хромосоме Наиболее часто трисомия X 47,ХХ, 21+; 47,ХY, 21+Синдром ДаунаТрисомия по 21-й хромосоме 47,ХХ, 18+; 47,ХY, 18+Синдром ЭдвардсаТрисомия по 18-й хромосоме 47,ХХ, 13+; 47,ХY, 13+Синдром ПатауТрисомия по 13-й хромосоме 46,XX, 5р-Синдром кошачьего крика делеция короткого плеча 5-й хромосомы 46 XX или ХУ, 15р-.Синдром Прадера-ВиллиАномалия 15 хромосомы Примеры болезней человека, вызванных аномалиями кариотипов

Х РОМОСОМНОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПОЛА В 1905 – 1906 г Вильсон открыл половые хромосомы и доказал их роль в детерминации пола В 1922 г.американский ученый Бриджес создал гипотезу генного баланса. Суть её: человек изначально бисексуален. Развитие половых признаков определяется балансом женских и мужских генов – детерминаторов пола У человека важную роль в детерминации пола играет У- хромосома

У организмов с хромосомным определением пола половыми хромосомами называют хромосомы, различно устроенные у мужских и женских организмов. По традиции половые хромосомы, в отличие от аутосом, обозначаются не порядковыми номерами, а буквами X, Y, Z или W, причём отсутствие хромосомы обозначается цифрой 0.

Как правило, при этом один из полов определяется наличием пары одинаковых половых хромосом ( гомогаметный пол, XX или ZZ ), а другой комбинацией двух непарных хромосом или наличием только одной половой хромосомы ( гетерогаметный пол, XY, ZW, X0, Z0 ). У птиц гетерогаметный пол женский (ZW), а гомогаметный мужской (ZZ). В некоторых случаях (у утконоса) пол определяется не одной, а пятью парами половых хромосом. Насколько распространены подобные схемы, не ясно, поскольку до недавнего времени были известны только случаи с одной парой половых хромосом.

Хромосомное определение пола у человека происходит по XY-механизму. При этом гетерогаметным полом является мужской, гомогаметным женский. Пол человека формируется в три этапа: хромосомный, гонадный и фенотипический

Большая часть генов У-хромосомы не имеет гомологов в Х хромосоме и наследуется только по мужской линии. Некоторые из этих генов связаны с детерминацией мужского пола. У человека присутствие У хромосомы в кариотипе обеспечивает развитие мужского пола. У- хромосома имеет короткое и длинное плечо. В коротком плече имеется ген, отвечающий за синтез фактора TDF, определяющего дифференцировку семенников.

Ф АКТОР TDF ( T ESTIS DETERMINING FACTOR ) ТДФ - фактор, определяющий тестикулы общий термин для генов и продуктов их действия, которые направляют развитие эмбриона по пути формирования мужской особи. Фактор TDF кодируется геном SRY, расположенным в Y-хромосоме. Он представляет собой ДНК-связывающий белок, который усиливает действие других факторов транскрипции или сам по себе является фактором транскрипции. Экспрессия этого гена прямо или косвенно приводит к появлению первичных половых тяжей, которые позднее развиваются в семенные канальцы.

Ф ИЗИОЛОГИЧЕСКАЯ ОСНОВА ГОНАДНОГО УРОВНЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПОЛА Физиологической основой механизма определения пола является бисексуальность эмбриональных гонад млекопитающих. В таких прогонадах одновременно присутствуют Мюллеров проток и Вольфов канал -зачатки половых путей соответственно самок и самцов. Первичная детерминация пола начинается с появления в прогонадах специализированных клеточных линий - клеток Серт Ò ли и Лèйдига.

Фактор TDF обеспечивает дифференцировку зачатка половой железы и образование двух групп клеток: клеток Сертоли и Лейдига. Клетки Сертоли выделяют антимюллеровский гормон Клетки Лейдига вырабатывают тестостерон и определяют дифференцировку Вольфового канала Группа ученых под руководством Чандры показали, что в У-хромосоме имеется участок гомологичный участку Х хромосомы, где находится ген SRY. Поэтому Х и У хромосомы могут обмениваться этими участками.

Ф ОРМИРОВАНИЕ ПОЛА У ЧЕЛОВЕКА

Д ОЗОВАЯ КОМПЕНСАЦИЯ ГЕНОВ В 1949 г. М. Барр обнаружил компактные глыбки хромосомного материала в ядрах нервных клеток у кошек, у котов таких глыбок не было. Эти структуры были названы тельцами Барра. В 1959 г. С. Оно прищел к выводу, что тельце Барра формируется из одной Х-хромосомы у самок млекопитающих. В 1961 г. М.Лайон сделала вывод, что дозовая компенсация генов, локализованных в Х- хромосоме млекопитающих, осуществляется за счет инактивации одной из двух родительских хромосом.

Половой хроматин Выяснено, что у женщин наряду с инактивацией почти всей Х – хромосомы наблюдается родительский импринтинг отдельных генов Х-хромосомы o Инактивации подвергается большая часть генов. o Выбор Х – хромосомы для инактивации случаен. o Инактивированная Х- хромосома выглядит как компактизированное красящее тельце – o Х – хроматин или половой хроматин

2. Геномный уровень организации наследственной информации

П ОНЯТИЕ О ГЕНОМЕ Геном – это совокупность всей ДНК, находящейся в клетке. Геном прокариот имеет небольшие размеры включает – нуклеоид – комплекс ДНК с негистоновыми белками и плазмиды – небольшие кольцевые молекулы ДНК Основная масса ДНК прокариот активно транскрибируется (95 %)

Г ЕНОМ ЭУКАРИОТ Включает ядерную и митохондриальную ДНК. ДНК митохондрий составляет 1% генома млекопитающих и составляет нп Размер генома человека – 3, нп, содержит до 1, 5 млн. генов, примерно 100 тысяч белков Большая часть генома эукариот не транскрибируется – молчащие участки Избыточность генома эукариот объясняется экзон – интронной структурой гена

Ядерный геном Человек – 3,5 х 10 9 пн Митохондриальный геном Размер – пн Г ЕНОМ ЭУКАРИОТ – СОВОКУПНОСТЬ ЯДЕРНОЙ И МИТОХОНДРИАЛЬНОЙ ДНК КЛЕТКИ

М ИТОХОНДРИАЛЬНЫЙ ГЕНОМ В состав митохондриального генома входит 37 генов, которые отвечают за рРНК, тРНК и 13 комплексов дыхательной цепи Геном митохондрий передается по материнской линии и обладает достаточной самостоятельностью, но структура митохондриальных белков образуется при участии ядерного генома

Я ДЕРНЫЙ ГЕНОМ КЛЕТКИ Ядерный геном – это совокупность наследственного материала в гаплоидном наборе хромосом Ядерный г еном обладает видоспецифичностью Человек – 3,5 х 10 9 пн, п=23 Мышь -3 х 10 9 пн, п= 20 Курица – 1,2 х 10 9, п =39 Поддержание постоянства организации наследственного материала на геномном уровне имеет первостепенное значение для нормального развития организма

Э ВОЛЮЦИЯ ГЕНОМА Существует гипотеза, что первые клеточные геномы имели избыточную ДНК способную реплицироваться Дальнейшая эволюция шла в двух направлениях: У прокариот Уменьшение размеров генома Увеличение интенсивности размножения и быстрая смена поколений У эукариот эволюция связана с нарастающим увеличением количества ДНК. Могла осуществляться несколькими путями: Полиплоидизацией Амплификацией нуклеотидных последовательностей Амплификация в процесс образования дополнительных копий участков хромосомной ДНК, как правило, содержащих определенные гены либо сегменты структурного гетерохроматина

? Перечислите виды хромосомных аберраций