Использование экспериментального и биоинформатического подходов для исследования ретротранспозонов в геномах эукариот Ольга Новикова Новосибирский государственный университет Институт цитологии и гентики СО РАН Новосибирск 2007

Ретротранспозоны ORF - открытая рамка считывания 5UTR и 3UTR - 5 и 3 нетранслируемые районы 5LTR и 3LTR - 5 и 3 длинные концевые повторы TSD – дуплицированные повторы-мишени Используют в процессе своего перемещения обратную транскрипцию.

Эволюция ретротранспозонов REL-endo ретротранспозоны – non-LTR ретротранспозоны с одной ORF APE ретротранспозоны – non-LTR ретротранспозоны с двумя ORF Pseudoviridae Metaviridae Retroviridae (Ty1/copia) (Ty3/gypsy) + Bel, DIRS

Ретротранспозоны: эволюция и распределение Цель:изучение распространения и эволюции ретротранспозонов в геномах эукариотических организмов. Задачи: 1. Исследование разнообразия non-LTR ретротранспозонов среди представителей отряда Scorpiones (Arachnida: Scorpiones). 2. Исследование разнообразия non-LTR ретротранспозонов среди представителей рода Maculinea (Lepidoptera: Lycaenidae). 3. Определение нуклеотидных последовательностей элементов, относящихся к различным группам non-LTR ретротранспозонов, из видов отряда Scorpiones и рода Maculinea. 4. Обработка последовательностей, изучение внутри- и межвидовой вариабельности, оценка разнообразия групп non-LTR ретротранспозонов в геномах видов отряда Scorpiones и рода Maculinea. Построение филогенетических деревьев non-LTR ретротранспозонов.

Ретротранспозоны: эволюция и распределение 5. Исследование разнообразия LTR ретротранспозонов с помощью биоинформатических подходов в геномах восьми эукариотических организмов, включая три вида грибов (Fungi) и пять видов животных (Animalia). 6. Исследование разнообразия и получение полных последовательностей LTR ретротранспозонов из геномов Aspergillus fumigatus и A. nidulans (Fungi: Ascomycota). Анализ нуклеотидных последовательностей, построение филогенетических деревьев LTR ретротранспозонов. 7. Исследование разнообразия и получение полных последовательностей LTR ретротранспозонов из генома Phanerochaete chrysosporium (Fungi: Basidiomycota). Анализ нуклеотидных последовательностей, построение филогенетических деревьев LTR ретротранспозонов.

Non-LTR ретротранспозоны Scorpiones 2 подотряда 10 семейств 21 род 22 вида скорпионов Три филогенетические группы были обнаружены в геномах Scorpiones CR1, Jockey и I Проведен ПЦР-анализ с использованием вырожденных праймеров, клонирование и секвенирование полученных продуктов. Полученные последовательности были использованы для сравнительного и филогенетического анализов - - Материал предоставлен Проф. Виктором Фетом (Marshall University, USA)

Non-LTR ретротранспозоны Scorpiones CR1 филогенетическая группаJockey филогенетическая группа I филогенетическая группа Подавляющее большинство фрагментов элементов представляли собой последовательности нарушенной RT.

Non-LTR ретротранспозоны Maculinea 4 вида: Maculinea teleius Maculinea nausithous Maculinea alcon Maculinea arion Проведен ПЦР-анализ с использованием вырожденных праймеров, клонирование и секвенирование полученных продуктов. Полученные последовательности были использованы для сравнительного и филогенетического анализов - - Представители рода Maculinea являются мирмекофилами и являются одним из интереснейших объектов изучения для экологов. Относятся к исчезающим видам. Четыре филогенетические группы были обнаружены в геномах Maculinea R4, Jockey, CR1 и R1 Материал предоставлен Проф. Михалом Войциховски (Jagiellonian University, Poland).

Non-LTR ретротранспозоны Maculinea Jockey филогенетическая группаR4 филогенетическая группа R4-подобные элементы обнаружены у всех исследованных Maculinea - семейство MacR4. Элементы MacR4 семейства имеют высокое сходство как внутри видов, так и между видами. Два семейства специфичны для M. arion. Jockey-подобные элементы обнаружены у всех исследованных Maculinea, за исключением M. arion. Jockey-подобные элементы разнородны, сходство на нуклеотидном уровне составляло в среднем 74%. Подавляющее большинство фрагментов R4 и Jockey элементов представляли собой последовательности интактной RT.

Non-LTR ретротранспозоны Maculinea R1 филогенетическая группа Три семейства в составе CR1 MacCR1A MacCR1B MacCR1C (T1Q) CR1 филогенетическая группа Сходство MacCR1A и MacCR1B элементов составляло в среднем 73.5% нуклеотидной последовательности и 88% на аминокислотном уровне. BLAST анализ показал наличие MacCR1B- подобных ретроэлементов в геноме Bombyx mori, причем сходство между MacCR1B и BmCR1B элементами составляло более 96% на нуклеотидном уровне.

BmCR1B non-LTR ретротранспозон Bombyx mori BmCR1B ретроэлемент был реконструирован на основе выравнивания геномных фрагментов B. mori. ORF - открытая рамка считывания 5UTR и 3UTR - 5 и 3 нетранслируемые районы RT - домен обратной транскриптазы APE - домен апурин/апиримидин эндонуклеазы

CR1A и CR1B семейства в геномах Lepidoptera CR1A CR1B Для исследования рапределения семейств CR1A и CR1B: Были выбраны 17 представителей отряда Lepidoptera, подотряда Ditrysia, относящиеся к 9-ти семействам. Были выбраны специфичные праймеры для семейств элементов CR1A и CR1B. Проведен ПЦР-анализ, клонирование и секвенирование полученных продуктов Материал предоставлен к.б.н. Олегом Костериным (ИЦиГ) и к.б.н. Владимиром Дубатоловым (ИСиЭЖ).

Горизонтальный перенос CR1B элементов Горизонтальный перенос – это процесс, благодаря которому может осуществляться перемещение генов у репродуктивно изолированных видов. Механизм неизвестен. Критерии: Неравномерное распределение - присутствие у эволюционно далеких видов. Скорость накопления замен в последовательностях мобильных элементов ниже, чем в последовательностях функциональных генов. - - Горизонтальный перенос 5-10 млн. лет назад

LTR ретротранспозоны в геномах эукариот Алгоритм HMM (Hidden Markov Model), основанный на скрытых цепях Маркова 1 Приложение HMM Search. 1. Eddy 1998 UniPro GenomeBrowser - Plugins - Поиск мобильных элементов по заданным характеристикам – наличие прямых или обратных повторов, наличие открытых рамок считывания. Приложение Find ME.

LTR ретротранспозоны в геномах эукариот Сaenorhabditis briggsae HMM сигнала Brugia malayi - 11 HMM сигналов Aedes aegypti HMM сигналов Ciona intestinalis HMM сигналов Danio rerio HMM сигналов 15 новых LTR элементов, относящихся к группам Metaviridae, DIRS и Bel.

LTR ретротранспозоны Aspergillus fumigatus и Aspergillus nidulans Aspergillus fumigatus - основной возбудитель инвазивных микозов. Более 90% случаев. Aspergillus nidulans - один из важнейших модельных организмов для исследований биологии клетки и регуляции генов. A. fumigatus - 60 HMM сигналов A. nidulans - 25 HMM сигналов Все элементы - Metaviridae A. fumigatus - 4 группы элементов A. nidulans - 2 группы элементов A. fumigatus и A. nidulans - большинство копий элементов имеют нарушения и замены C:G на T:A

Aspergillus fumigatus: Afut1, Afut2, Afut3, Afut4 Aspergillus nidulans: Dane3, Dane4 + Dane1, Dane Neuveglise et al Paris S, Latge JP Nielsen et al LTR ретротранспозоны Aspergillus fumigatus и Aspergillus nidulans ORF - открытая рамка считывания; 5LTR и 3LTR - 5 и 3 длинные концевые повторы; RT - домен обратной транскриптазы; RNase H - домен рибонуклеазы Н; Int - интеграза; ССНН и CCHC - цинковые пальцы; Сhromo - хромодомен; * - стоп- кодоны.

Гомолог-зависимая инактивация повторенных последовательностей грибов Neurospora crassa - RIP инактивация. Мутагенез, индуцированный повторяющимся последовательностями (RIP – repeat induced point mutations) 1 1. Galagan and Selker RIP-анализ Подсчет частот встречаемости CpG, TpG, CpA и TpA динуклеотидов. Сравнение частот встречаемости между генами и LTR ретротранспозонами. Реконструкция de-RIP элемента. F[CpG] = O[CpG]/E[CpG], где O[CpG] – наблюдаемое число сайтов CpG в последовательности, E[CpG] – ожидаемое число CpG сайтов, E[CpG]=[C]x[G]/L, где [C] и [G] - число C и G в последовательности, L – длина последовательности - - -

Инактивация LTR ретротранспозонов Aspergillus fumigatus и Aspergillus nidulans Бокс-плот частот встречаемости CpG, TpA, CpA и TpG сайтов в последовательностях Afut1, Afut2 и генов из Aspergillus fumigatus Бокс-плот частот встречаемости CpG, TpA, CpA и TpG сайтов в последовательностях Dane4 и генов из Aspergillus nidulans Сравнительный анализ частот встречаемости CpG, TpA, CpA и TpG сайтов для ретроэлементов и генов показал, что элементы Afut1 и Afut2 из A. fumigatus и Dane4 из A. nidulans подверглись RIP инактивации по CpG и CpA сайтам.

LTR ретротранспозоны Phanerochaete chrysosporium Pseudoviridae - 51 HMM сигнал Metaviridae HMM сигналов Pseudoviridae - 8 Pc_Pseudovir элементов Metaviridae - 15 Pc_Metavir элементов Pseudoviridae - 6 элементов представлены полноразмерными интактными копиями Metaviridae - 7 элементов представлены полноразмерными интактными копиями Phanerochaete chrysosporium - один из немногих грибов-базидиомицетов (Basidiomycota), способных разлагать лигнин, главный компонент клеточной стенки растений.

Pseudoviridae из Phanerochaete chrysosporium Копийность от 2 до 10 и более копий на геном. Гомология между копиями элементов составляла от 85% до 99% нуклеотидной последовательности. Гомология между 5 и 3 LTR составляла от 91.2% до 100%. Обнаружены соло LTR (кроме Pc_Pseudovir1 и Pc_Pseudovir2).

Pseudoviridae из Phanerochaete chrysosporium ORF - открытая рамка считывания; 5LTR и 3LTR - 5 и 3 длинные концевые повторы; RT - домен обратной транскриптазы; Int - интеграза; CCHC – цистеиновый мотив; PEP_A3 - протеаза; * - стоп-кодон; TSD - повторы-мишени.

Metaviridae из Phanerochaete chrysosporium Копийность от 1 до 50 и более копий на геном. Гомология между копиями элементов составляла от 82% до 99% нуклеотидной последовательности. Гомология между 5 и 3 LTR составляла от 90.4% до 100%. Обнаружены соло LTR Pc_Metavir1,2,3 и 5. Большинство Pc_Metavir относятся к филогенетической группе Chromovirus.

Metaviridae из Phanerochaete chrysosporium ORF - открытая рамка считывания; 5LTR и 3LTR - 5 и 3 длинные концевые повторы; RT - домен обратной транскриптазы; Int - интеграза; PR - протеаза; dUTPase - катализирует гибролиз dUTP; chromo - хромодомен; CCHC – цистеиновый мотив; * - стоп-кодон; TSD - повторы-мишени.

Metaviridae из Phanerochaete chrysosporium ORF - открытая рамка считывания; 5LTR и 3LTR - 5 и 3 длинные концевые повторы; RT - домен обратной транскриптазы; Int - интеграза; PR - протеаза; CCHC – цистеиновый мотив; * - стоп-кодон; TSD - повторы-мишени. Столь высокое разнообразие LTR ретротранспозонов в геноме одного вида грибов показано впервые. В общей сложности LTR ретротранспозоны составляют около 3% от генома P. chrysosporium.

Выводы 1. Исследовано разнообразие non-LTR ретротранспозонов в геномах 22- х видов отряда Scorpiones. Показано присутствие трех филогенетических групп non-LTR ретротранспозонов (CR1, Jockey и I) и множественных линий внутри каждой из них. 2. Исследовано разнообразие non-LTR ретротранспозонов в геномах четырех видов бабочек рода Maculinea. Показано присутствие четырех филогенетических групп non-LTR ретротранспозонов (CR1, R1, Jockey и R4) и наличие множественных линий внутри них, в частности, двух близкородственных семейств MacCR1A и MacCR1B внутри филогенетической группы CR1. 3. Обнаружен BmCR1B элемент в геноме Bombyx mori, имеющий высокое сходство с MacCR1B элементом Maculinea. 4. Проведено исследование распределения CR1A и CR1B семейств среди Lepidoptera. Обнаружен горизонтальный перенос CR1B non-LTR ретротранспозонов между представителем семейства Bombycidae и общим предком рода Maculinea более 5 млн. лет назад.

Выводы 5. Исследовано разнообразие LTR ретротранспозонов в геномах восьми эукариотических организмов, включая три представителя царства грибов (Fungi) и пять представителей царства животных (Animalia). Было обнаружено 42 новых, ранее не описанных, LTR ретротранспозонов. 6. Проведен анализ геномов двух аскомицетов, Aspergillus fumigatus и A. nidulans. Для каждого вида было обнаружено по два семейства LTR ретротранспозонов, которые не были описаны ранее. 7. Проведенный RIP анализ убедительно показал, что последовательности LTR ретротранспозонов A. fumigatus и A. nidulans несут отпечатки действия RIP-подобной инактивации. 8. Исследовано разнообразие LTR ретротранспозонов в полной геномной последовательности лигнин-деградирующего базидиомицета Phanerochaete chrysosporium. Было обнаружено 8 новых Pseudoviridae и 15 элементов группы Metaviridae. Столь высокое разнообразие LTR ретротранспозонов в геноме одного вида грибов показано впервые. Большинство обнаруженных LTR ретротранспозонов P. chrysosporium представлены в геноме интактными полноразмерными копиями, которые относительно недавно перемещались. В общей сложности LTR ретротранспозоны составляют около 3% от генома P. chrysosporium.

Финансовая поддержка: Программа Президиума РАН "Происхождение и эволюция биосферы" /П-18/ / /28/ This study was financed by EC within its RTD project MacMan EVK2-CT