2. Комплексы биополимеров с лигандами. Специфические взаимодействия. Методы определения констант равновесия Физико-химические основы биокатализа в иллюстрациях 2. Комплексы биополимеров с лигандами. Специфические взаимодействия. Методы определения констант равновесия

Простейшая модель взаимодействия биополимера с лигандом (модель двух состояний) P + L PL (P – полимер, L – лиганд, PL – комплекс ) k асс k асс – константа скорости ассоциации, [M] -1 [t] -1 k дисс – константа скорости диссоциации, [t] -1 К асс = k асс / k дисс термодинамическая константа ассоциации, [М] -1 К дисс = 1/ К асс = k дисс / k асс термодинамическая константа диссоциации, [М] ( К дисс или К D характеризует сродство лиганда к полимеру) k дисс

P t =[P]+[PL] L t =[L]+[PL] К D ? [P]? [L]? [PL]?

t

P + L L P L 1 2 C L1 ? C L2 ? Метод равновесного диализа

В равновесии концентрация лиганда в ячейке, свободной от полимера, равна концентрации свободного лиганда в ячейке, содержащей полимер: C L1 =C L2 Количество связанного лиганда: n PL = n 0 – n 1 – n 2, где n 0 – общее количество лиганда, n 1 и n 2 – количество свободного лиганда в первой и второй ячейках, n PL – количество комплекса. Условия: Величина n PL не должна представлять собой малую разность двух больших величин, то есть не должно быть большого избытка лиганда над биополимером и должна быть достаточно высокой степень комплексообразования. При большом избытке лиганда заведомо относительное изменение количества свободного лиганда будет невелико. При малой степени комплексообразования также величины n 1 +n 2 в сумме будут близки к n 0.

Метод равновесного диализа Условия: Разность P t -[PL] не должна быть мала по сравнению с P t и [PL], т.е. заметная часть биополимера также должна остаться в несвязанном состоянии. Данные условия выполняются, если: C P ~C L ~K D – Если n 1 +n 2 ~ n 0, то необходимо повышать концентрацию обоих компонентов. – Если, наоборот, слишком малая часть биополимера оказалась вне комплекса, то концентрацию следует уменьшать.

Метод равновесного диализа Выражение для константы диссоциации через найденные экспериментально величины n 1, n 2 и заданные величины n 0 и P t запишется в виде: К D = n 1 (P t -[PL])/(n 0 -n 1 -n 2 ) [PL] = (n 0 -n 1 -n 2 )/V где V – объем ячейки

Определение K D в случае, когда усвободного биополимера или лиганда какое-либо измеряемое физическое свойство (Ф) достаточно изменяется при комплексообразовании Определение K D в случае, когда у свободного биополимера или лиганда какое-либо измеряемое физическое свойство (Ф) достаточно изменяется при комплексообразовании: Для полимера: Ф = α Р Ф Р + α PL Ф PL Для лиганда: Ф = α L Ф L + α PL Ф PL где α Р, α PL, α L – соответствующие мольные доли Ф Р или Ф L находят измерением в отсутствие второго партнера. Ф PL – находят путем измерения при избытке второго партнера: проводят серию измерений при возрастающей концентрации второго партнера до тех пор, пока зависимость измеряемой величины от концентрации этого партнера не выйдет на плато.

Если обозначить значение измеряемой величины в отсутствие второго партнера через Ф 0, а предельное значение через Ф, то для величины α PL нетрудно получить выражение: α PL = Концентрация комплекса PL находится как: P t α PL,если измеряется характеристика полимера, L t α PL, если измеряется характеристика лиганда. Ф - Ф 0

Метод флуоресцентного титрования

Исследование комплексообразования биополимер-лиганд методом ЯМР Низкомолекулярные лиганды, как правило, имеют характерные линии в спектрах ЯМР и в ряде случаев удается выбрать линии, не налагающиеся полностью на линии биополимера. При образовании комплекса может произойти смещение линии поглощения, т.е. изменение величины химического сдвига. В случае не очень прочных комплексов невозможно наблюдать раздельно линии для свободного и связанного лиганда. Так как современные приборы работают на частотах порядка 10 8 с -1, а смещение сигналов в результате комплексообразования имеет порядок миллионных долей, т.е , время жизни комплекса порядка с уже не допускает раздельной регистрации двух состояний. Так как современные приборы работают на частотах порядка 10 8 с -1, а смещение сигналов в результате комплексообразования имеет порядок миллионных долей, т.е , время жизни комплекса порядка с уже не допускает раздельной регистрации двух состояний.

Определение К асс в координатах Скечерда L b (bound) – связанный в комплекс лиганд L f (free) – свободный лиганд К асс == P t К асс - К асс L b Если полимер имеет несколько одинаковых и невзаимодействующих центров связывания n (например, в случае, когда белок состоит из нескольких идентичных субъединиц): = nP t К асс - К асс L b

При предельном количестве связанного лиганда (L b ) выражение можно записать в виде: = К асс (L b - L b ) Вместо величин L b, L b можно использовать любое свойство системы, пропорциональное концентрации комплекса. В случае реакций, катализируемых ферментами (Е), процесс превращения лиганда-субстрата (S), происходит в комплексе фермент-субстрат (ES), и выражение для скорости превращения субстрата можно написать в виде: = К асс (v - v) Если лиганд в избытке, то концентрация свободного лиганда равна полной концентрации лиганда P t, и можно записать: = К асс (L b - L b ) или L b = или для ферментативной реакции = К асс (v - v) или v =

Релаксационные методы. Метод температурного скачка Δx=Δx 0 exp{-(К асс ([P]+[L])+К дисс )t} где Δx 0 – предельное изменение измеряемого свойства при переходе от начального положения равновесия к конечному, Δx – текущая величина. Из экспоненциальной зависимости легко определяется величина К асс ([P]+[L])+ К дисс, если провести измерение при нескольких (минимум двух) значениях концентраций компонентов, то константы диссоциации и ассоциации легко находятся. Равновесные условия Неравновесные условия Равновесные условия нагрев релаксация

Комплексы биополимер-два лиганда P + L 1 PL 1 (K 1 ) PL 1 + L 2 PL 1 L 2 (K 2 ΄) P + L 2 PL 2 (K 2 ) PL 2 + L 1 PL 1 L 2 (K 1 ́) Должно выполняться соотношение: K 1 K 2 ΄= K 1 ́K 2 K 1 /K 1 = K 2 ΄/K 2 = α

Из соотношений: P t = [P] + [PL 1 ] + [PL 2 ] + [PL 1 L 2 ] = K 1, = K 2, = αK 1 K 2 находится выражение для концентрации несвязанного с лигандами биополимера через полную концентрацию и концентрацию свободных лигандов, а также выражение для всех трех комплексов биополимера с лигандами: [P] = [PL 1 ] = [PL 2 ] = [PL 1 L 2 ] =