Тема: ХРОМАТОГРАФИЯ

вопросы: Основные вопросы: 1. Классификация хроматографических методов 2. Элементы кинетической теории элюент- ной хроматографии 3. Адсорбционная хроматография 4. Ионообменная хроматография 5. Эксклюзионная хроматография 6. Аффинная хроматография

ЦВЕТ М.С. (1872 – 1919гг.) ХРОМА – цвет; ГРАФЕ - писать

Неподвижная(стационарная) фаза: 1. тонкоизмельченное вещество; 2. неподвижная вода Подвижная(мигрирующая) фаза: 1. жидкость; 2. газ

Сущность хроматографии: это процесс, основанный на различии в скоростях движения исследуемых ком- понентов; это процесс, основанный на различии в скоростях движения исследуемых ком- понентов; динамический характер процесса; динамический характер процесса; многократное повторение процессов сорб- ции и десорбции многократное повторение процессов сорб- ции и десорбции

Классификация хроматографических методов По характеру фаз подвижной и неподвижной По технике проведения По механизму взаимодействия сорбента и сорбата По агрегатному состоянию подвижной фазы: - газовая; - жидкостная. 2. непод- вижной фазы: 2. По агрегатному состоянию непод- вижной фазы: - газотвердофазная; - газожидкостная. 1. Колоночная 2. Плоскостная (тонкослойная или бумажная) 1. Адсорбционная 2. Ионообменная 3. Эксклюзионная 4. Аффинная 5. Распредилитель- ная

Коэффициент распределения CsCsCsCs К =, где К =, где C m C m C s - концентрация вещества в неподвиж- ной фазе, моль/л; C m - концентрация вещества в подвижной фазе, моль/л

Схема колоночной хроматографии двухкомпонентной смеси Смесь А + В Растворитель сорбент В А В А В А В Детектор Сигнал детектора Конец опыта А В Время или объем элюата

Процесс вымывания из колонки растворенных веществ пропусканием чистого растворителя называется элюированием, а такой способ разделения – элюентной хроматографией

Кинетическая теория элюентной хроматографии L – длина колонки; t m – время перемещения растворителя через колонку; t – время перемещения молекул вещества через колонку; L/ t m = V m - скорость перемещения через колонку растворителя; L/ t = V - скорость перемещения через колонку вещества;

V L/t t m = = = R - индекс удерживания; V m L/t m t R – индекс удерживания вещества подвижной фазой, т.е. доля времени нахождения молекулы вещества в подвижной фазе или доля вещества в подвижной фазе; (1 – R) – доля времени, проведенного молекулой вещества в неподвижной фазе или доля вещества в неподвижной фазе

R C m V m R C m V m = ( 1 ), где = ( 1 ), где 1 – R C s V s 1 – R C s V s C m, C s - молярные концентрации вещества, моль/л C m, C s - молярные концентрации вещества, моль/л V m, V s объемы подвижной и неподвижной фаз, л V m, V s - объемы подвижной и неподвижной фаз, л C s Так как Так как K =, то C s = K C m, C m R C m V m R C m V m Подставляем в (1) :, получаем Подставляем в (1) : =, получаем 1 – R K C m V s

V m R = R = KV s + V m R K V s = (1 - R) V m R K V s = V m - RV m R K V s + RV m = V m R (KV s + V m ) = V m

Схема колоночной хроматографии двухкомпонентной смеси Смесь А + В Растворитель сорбент В А В А В А В ДетекторКонец опыта К(В) К(А) R(B) R(A)

Aдсорбционная хроматография Сорбенты: Полярные: Неполярные: Полярные: Неполярные: - оксид алюминия (Al 2 O 3 nH 2 O) - активированный уголь - силикагель (SiO 2 nH 2 O) - графитированная сажа - крахмал - целлюлоза Растворители: вода, спирты, бензол, гексан и другие углеводороды вода, спирты, бензол, гексан и другие углеводороды

Адсорбция веществ из растворов зависит: 1. природы разделяемых веществ; 2. природы адсорбента (Simila similus solventuz); 3. природы растворителя; 4. температуры

Ионнообменная хроматография - это адсорбция электролитов из водных растворов на твердых адсорбентах Иониты – твердые природные или синтетические вещества, содержащие в своем составе функциональные группы, ионы которых способны обмениваться на ионы того же знака, находящиеся в растворе

Схема структуры ионита (катионита) 1 – матрица ионита (каркас); 1 – матрица ионита (каркас); 2 – функциональные группы ( ковалентно свя- заны с матрицей); 2 – функциональные группы ( ковалентно свя- заны с матрицей); 3 – противоионы ( электростатически связаны с ионогенными группами) 3 – противоионы ( электростатически связаны с ионогенными группами)

По знаку обменивающихся ионов иониты делятся: 1. Катиониты: R – SO 3 – H + ; R – COO – H + ; R – S – H + 2. Аниониты: R + – OH – R + – OH – 3. Амфолиты: N + (CH 3 )OH – N + (CH 3 )OH – R SO 3 – H + SO 3 – H + R – матрица ионита

Обменная емкость это количество ммоль эквивалентов ионов, которые может обменять 1г сухого или 1мл набухшего ионита на ионы, находящиеся в растворе это количество ммоль эквивалентов ионов, которые может обменять 1г сухого или 1мл набухшего ионита на ионы, находящиеся в растворе СИ: СИ: [ммоль/г], [ммоль/мл]

Схема ионообменного обессоливания воды Катионит: 2R – An – H + + CaCl 2 (R – An – ) 2 Ca HCl Анионит: R – Kt + OH – + HCl R – Kt + Cl – + H 2 O Исходная вода Диминерализованная вода катионит анионит III

Ионная адсорбция зависит: От величины заряда адсорбируемых ионов: От величины заряда адсорбируемых ионов: K + Ca 2+ Al 3+ Th 4+ От радиуса иона в сольватированном состоянии: От радиуса иона в сольватированном состоянии: Li + Na + K + Rb + Cs + увеличение гидратации увеличение адсорбции

Эксклюзионная хроматография - основана на распределение молекул, в соответствии с их размерами, между растворителем, заполняющим поры сорбента и протекающим между частицами сорбента неподвижная фаза - растворитель в порах сорбента; подвижная фаза – вытекающий из колон- ки растворитель

Эксклюзионная хроматография гель-проникающая гель-фильтрационная Гель – это сорбент, который готовится на основе природных или синтетических соединений, содержит поры определен- ного размера

Схема гель-фильтрации поток растворителя поток растворителя - гранулы геля - большие молекулы - малые молекулы абв

V В – вода в гранулах геля (неподвижная фаза); V Н – вода, окружающая гранулы (подвижная фаза); ОБЪЕМ КОЛОНКИ : V = V В + V Н +V М V В – вода в гранулах геля (неподвижная фаза); V Н – вода, окружающая гранулы (подвижная фаза); V М – объем матрицы геля C s - концентрация вещества в V В ; C m - концентрация вещества в V Н ; K – коэффициент распределения C s C s - концентрация вещества в V В ; K =, C m C m - концентрация вещества в V Н ; K – коэффициент распределения

1. Если К = 0, то вещество совершенно не проникает в гранулы геля; 2. Если 0 К 1, то вещество лишь частично проникает в гранулы; 3. Если К = 1, то вещество равномерно распределяется внутри и вне гранул

Схема фракционирования полимеров Смесь альбумина и инсулина голубой декстран сефадекс G-100 Растворитель 1. декстран Mr = ; 2. альбумин Mr = ; 3. инсулин Mr = 5 000

Гель - хроматограмма декстран альбумин инсулин V, мл С моль/л

Гель - хроматограмма декстран альбумин инсулин V0V0V0V0 V R1 V R2 V, мл С моль/л К =, где V R - V O V t - V O V t –общий объем колонки V o – исключающ. объем колонки V R –элюирующий объем в-ва

Графическая зависимость К от lg относительной молекулярной массы маркерных белков К КхКхКхКх lg M r исследуемого белка (Х) G - 100

Афинная хроматография метод очистки и разделения белков, основанный на их взаимодействии со специфическим лигандом, ковалентно связанным с инертным носителем матрицей

Аффинная хроматография матрица лиганд м + л белки Биоактив. в - во комплекс белки десорбция