ВНИИ растениеводства им. Н.И. Вавилова, отдел генетики, лаборатория иммунитета Идентификация генов устойчивости пшеницы к листовой ржавчине с помощью ПЦР ДНК маркеров: реальность или артефакт Л.Г. Тырышкин

Листовая (бурая) ржавчина пшеницы (возбудитель - Puccinia recondita f.s. tritici) Известно более 60 Lr генов устойчивости

Методы идентификации генов устойчивости пшеницы к листовой ржавчине 1.ГИБРИДОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ 2. ФИТОПАТОЛОГИЧЕСКИЙ ТЕСТ 3.ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МОЛЕКУЛЯРНЫХ МАРКЕРОВ

ГИБРИДОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ Анализ F2 от скрещивания изучаемого образца с носителем конкретного гена устойчивости Наличие расщепления – гены разные Отсутствие расщепления - один и тот же ген резистентности Недостатки 1. Относительная трудоемкость 2. Длительность 3. Желательно наличие изогенных линий 4. Необходима коллекция клонов патогена, авирулентных ко всем идентифицируемым генам

Ген Lr13 Образцы пшеницы ThLr13 Клон патогена ФИТОПАТОЛОГИЧЕСКИЙ ТЕСТ Заражение изучаемого образца и тестера конкретного гена устойчивости несколькими клонами патогена. Совпадение реакции – один и тот же аллель резистентности Отсутствие совпадения – аллели разные Недостатки 1. Желательно наличие изогенных линий 2. Необходима коллекция клонов патогена 3. Невозможность проведения при отсутствии различий по вирулентности клонов к изучаемому образцу Рис.1. Идентификация гена Lr13 у образцов пшеницы

клонов к изучаемому образцу Рис. 2. Схема Полимеразной цепной реакции (ПЦР)

Аллель устойчивости Продукт амплификации Аллель восприимчивости Продукт амплификации Нет Рис.3 Схема идентификации гена устойчивости с использованием ПЦР ДНК маркера

Преимущества 1. срок идентификации 2. отсутствие супрессии 3. независимость от внешних условий 4. большое количество маркеров ().

Гены устойчивости пшеницы к листовой ржавчине, для которых разработаны ПЦР ДНК маркеры (по McIntosh et al, 2008) Lr1, Lr3, Lr9, Lr10, Lr13, Lr14a, Lr16, Lr19, Lr20, Lr21, Lr22, Lr24, Lr25, Lr26, Lr28, Lr29, Lr32, Lr34, Lr35, Lr37, Lr39, Lr46, Lr47, Lr50, Lr51, Lr52, Lr57, Lr58.

Публикации, в которых идентификация генов устойчивости пшеницы к листовой ржавчине осуществлена только по результатам анализа ПЦР ДНК маркеров (всего более 20) Гайнуллин Н.Р., Лапочкина И.Ф., Жемчужина А.И., Киселева М.И., Коломиец Т.М., Коваленко Е.Д. Использование фитопатологического и молекулярно-генетического методов для идентификации генов устойчивости к бурой ржавчине у образцов мягкой пшеницы с чужеродным генетическим материалом // Генетика Т. 43. С Гультяева Е.И., Канюка И.А., Алпатьева Н.В., Баранова О.А., Дмитриев А.П., Павлюшин В.А. Молекулярные подходы в идентификации генов устойчивости к бурой ржавчине у российских сортов пшеницы // Доклады РАСХН С Дженин С.В., Лапочкина И.Ф., Жемчужина А.И., Коваленко Е.Д. Доноры устойчивости яровой мягкой пшеницы к бурой ржавчине и мучнистой росе с генетическим материалом видов Aegilops speltoides L., Aegilops triuncialis L., Triticum kiharae Dorof. et Migusсh. //ДокладыРАСХН N 5. С Урбанович О.Ю., Малышев С.В., Долматович, Картель Н.А. Определение генов устойчивости к бурой ржавчине в сортах пшеницы (Triticum aestivum L.) с использованием молекулярных маркеров // Генетика V. 42. С Stepien L., Golka L., Chelkowski J. Leaf rust resistance genes of wheat: identification in cultivars and resistance sources // J. Appl. Genet V. 44. P Greganova Z., Kraic J., Galova Z. Diagnostic of wheat leaf rust resistance genes by DNA markers and their application in mas // Czech J. Genet. Plant Breed. – – V.39. – P.127–129. Wioeniewska H., Stкpieс Ј., Kowalczyk K. Resistance of spring wheat cultivars and lines to leaf rust // J. Appl. Genet. 44(3), 2003, P Singh R., Tiwari R., Datta D. Detection of Leaf Rust Resistance Genes Lr9 and Lr10 in Wheat (Triticum aestivum) by PCR Based STS Markers //Acta Phytopath et Ent. Hungarica V. 38. P Babar M., Mashhadi A.F., Mehvish A. et al. Identification of rust resistance genes Lr10 and Sr9a in Pakistani wheat germplasm using PCR based molecular markers African Journal of Biotechnology Vol. 9(8), pp

Аллель устойчивости Мутации аллель устойчивости + аллель устойчивости – маркер – маркер + Рекомбинация аллель устойчивости + аллель устойчивости – маркер – маркер + Рис.4 Возможные механизмы нарушения связи наличия аллеля устойчивости и ПЦР ДНК маркера

Аллель устойчивости Мутации аллель устойчивости + аллель устойчивости – маркер – маркер + Рекомбинация аллель устойчивости + аллель устойчивости – маркер – маркер + Рис.5 Возможные механизмы нарушения связи наличия аллеля устойчивости и ПЦР ДНК маркера

М М Рис. 6. Продукты амплификации с использованием праймеров J 13 к STS локусу, сцепленному с геном устойчивости Lr9. М – маркер молекулярного веса, 1 – АНК-4, 2 – Гарасовскя 5, 3 – Зоя, 4 – Квинта, 5 – Киевская, 6 – Cep 14 –Tapes, 7– Thatcher п.о. Абсолютное совпадение результатов идентификации гена устойчивости мягкой пшеницы к листовой ржавчине с помощью ПЦР ДНК маркера, гибридологического анализа и фитопатологического теста

Таблица 1. Характеристика образцов, выделенных как имеющих ген Lr9, по устойчивости к листовой ржавчине и наличию амплифицированного фрагмента STS маркера J13. Образец Тип реакции на заражение, инокулюм Наличие фрагмента амплификации популяция клоны, вирулентные к гену Lr9 ThLr903+ АН АНК-403+ Гарасовская 503+ Дуэт03+ Зоя03+ Линия F6BC5 555/1503+ Лютесценс Удача03+ GKB-103+ TR/55P

Рис. 7 Продукты амплификации с использованием праймеров J09 к STS локусу, сцепленному с геном устойчивости Lr24. М – маркер молекулярного веса, 1 – N89L, 2 – Siouxland 89, 3 – Parker 76, 4 – Arapohoe, 5 – Лавина, 6 –Stoa, 7 – STW , 8 – Torres, 9 – PS 131, 10 – PS 133, 11 – Scua, 12 – BR- 34, 13 – PF 84316, 14 – Sunco, 15 – Thatcher. М М 310 п.о. Не полное совпадение результатов идентификации гена устойчивости с помощью ДНК маркера, гибридологического анализа и фитопатологического теста

Образец Тип реакции на заражение, инукулюм Наличие STS маркера популяцияклоны, вирулентные к Lr24 Th Lr2400, 3+ Лавина03+ Arapohoe03+ Collin03+ Gus03+ Norkan03+ Parker Siouxland SST Stoa03+ STW Tules03+ BR Scua03- Torres03- Century03- Cimmaron03- MN OC Таблица 2. Характеристика образцов, выделенных как имеющих ген Lr24, по устойчивости к листовой ржавчине и наличию амплифицированного фрагмента STS маркера J9.

Не совпадение результатов идентификации генов устойчивости с помощью ДНК маркеров и фитопатологического теста (образцы, для которых выявлено не совпадение отмечены красным) Сорт, образец Ген устойчивости по результатам STS анализа Клон DoublecropLr ХазаркаLr RoblinLr OmegaLr PasquaLr HopeLr ПрохоровкаLr РодинаLr Тэтчер ThLr Таблица 3. Типы реакции сортов мягкой пшеницы на заражение клонами P. triticina, авирулентными к гену устойчивости Lr1

Сорт, образец Ген устойчивости по результатам STS анализа Клон ЗаряLr OmegaLr201-2 PlanetLr Тэтчер ThLr Таблица 4. Типы реакции сортов мягкой пшеницы на заражение клонами P. triticina, авирулентными к гену устойчивости Lr20 Сорт, образец Ген устойчивости по результатам STS анализа Клон EquinoxLr ХазаркаLr ProspectLr ПрохоровкаLr Тэтчер ThLr Таблица 5. Типы реакции сортов мягкой пшеницы на заражение клонами P. triticina, авирулентными к гену устойчивости Lr26

Таблица 6. Типы реакции сортов мягкой пшеницы на заражение клонами P. triticina, авирулентными к гену устойчивости Lr10 Сорт, образецГен устойчивости по результатам STS анализа Клон 1234 PikoLr BrigadierLr100;0;303 VanceLr100;033 Lerma Rojo 64Lr100;330 RendezvousLr100;233 ProspectLr AC DomainLr LeguanLr HopeLr ПрохоровкаLr СаррубраLr RoblinLr Харьковская 26Lr Манна 2Lr АнгелинаLr Мильтрум 63Lr Эскада 70Lr МаринкаLr Мальцевская 110Lr ЭстерLr Воронежская 16Lr РодинаLr ThLr100000

Сорт, образец Ген устойчивости по результатам SSR анализа Клон 1234 Lerma Rojo 64Lr34X333 ЗаряLr ManitouLr340; PasquaLr340; DoublecropLr AC DomainLr340; RoblinLr340; Тэтчер3333 ThLr340; Таблица 7. Типы реакции сортов мягкой пшеницы на заражение клонами P. triticina, авирулентными к гену устойчивости Lr34

100 п.о. М Р и с. 8 Продукты амплификации с использованием праймеров WMS130 к SSR локусу Xgwm130, сцепленному с геном устойчивости Lr34 М – маркер молекулярного веса, 1 – Thatcher Lr13, 2 – Chris, 3 – Neepawa, 4 – Thatcher Lr10, 5 – Mayo 54, 6 – Mayo 52, 7 – Эскада 70, 8 – Hope, 9 – Piko, 10 – Rendezvouz, 11 – Prospect, 12 – Прохоровка, 13 – Эстер, 14 – Родина, 15 – Thatcher Lr34, 16 –Doubleсrop, 17 – Lerma Rojo 64, 18 – Roblin, 19 – Заря, 20 – Manitou, 21 – Pasqua, 22 – Thatcher. Т а б л и ц а 8. Типы реакции отрезков листьев образцов пшеницы на инокуляцию монопустульными изолятами P. recondita f.sp. tritici Образец Номер монопустульного изолята 12 ThLr340; Doublecrop33 Lerma Rojo 6433 Mayo 5233 Mayo 5433 Prospect33 Rendezvous30 Эскада 7033 Эстер33 Thatcher33

300 п.о. М Р и с. 9 Продукты амплификации с использованием праймеров к STS локусу F12245, сцепленному с геном устойчивости Lr10 М – маркер молекулярного веса, 1 – Thatcher Lr13, 2 – Chris, 3 – Neepawa, 4 – Thatcher Lr10, 5 – Mayo 54, 6 – Mayo 52, 7 – Эскада 70, 8 – Hope, 9 – Piko, 10 – Rendezvouz, 11 – Prospect, 12 – Прохоровка, 13 – Эстер, 14 – Родина, 15 – Thatcher Lr34, 16 –Doubleсrop, 17 – Lerma Rojo 64, 18 – Roblin, 19 – Заря, 20 – Manitou, 21 – Pasqua, 22 – Thatcher. Т а б л и ц а 9. Типы реакции отрезков листьев образцов пшеницы на инокуляцию монопустульными изолятами P. recondita f.sp. tritici Образец Номер монопустульного изолята 12 ThLr1000 Piko33 Rendezvous33 Заря33 Родина33 Эскада 7033 Thatcher33

НЕ СОВПАДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИДЕНТИФИКАЦИИ ГЕНОВ УСТОЙЧИВОСТИ Lr 9 и 24 У ОБРАЗЦОВ AEGILOPS UMBELLULATA И ЛИНИЙ МЯГКОЙ ПШЕНИЦЫ С ЧУЖЕРОДНЫМИ ТРАНСЛОКАЦИЯМИ С ПОМОЩЬЮ ДНК МАРКЕРОВ, И ФИТОПАТОЛОГИЧЕСКОГО ТЕСТА

Номе каталога либо интродукции ВИР Тип реакции на заражение P. triticinaНаличие маркера размером 1100 п.о. популяцияклоны, вирулентные к Lr Таблица 10. Характеристика образцов Aegilops umbellulata по устойчивости к листовой ржавчине и наличию амплифицированного фрагмента STS маркера J п.о. 850 п.о. Рис. 11 Продукты амплификации с использованием праймеров J 13 к STS локусу, сцепленному с геном устойчивости Lr9. М – маркер молекулярного веса, 1 – к-1283, 2 – Thatcher, 3 – ThLr9, 4 – к-2029, 5 – и , 6 – к-1461, 7– и , 8 – и , 9 - и М

Образец, линия Устойчивость от Идентифицированные гены устойчивости методом ПЦР-анализа Наличие вирулентных клонов P. triticina Lr 9Lr 24 76/00Ae. speltoides+-+ 79/00Ae. speltoides /00T. kiharae /00T. kiharae /00-1Ae. triuncialis-++ k-1652Ae. triuncialis+-+ Гайнуллин и др., Дженин и др., Таблица 11. Характеристика образцов мягкой пшеницы с чужеродным генетическим материалом по наличию ДНК маркеров и вирулентных клонов возбудителя листовой ржавчины