Изучение генетического контроля устойчивости зерновых культур к болезням (на примере листовой ржавчины пшеницы) ВНИИ растениеводства им. Н.И. Вавилова, - презентация

1 Изучение генетического контроля устойчивости зерновых культур к болезням (на примере листовой ржавчины пшеницы) ВНИИ растениеводства им. Н.И. Вавилова, отдел генетики, лаборатория иммунитета

2 Создание устойчивых к грибным заболеваниям сортов хлебных злаков составляет одну из очередных задач современной селекции сельско- хозяйственных растений (Вавилов, 1913). Симптомы поражения листовой ржавчиной А – флаг-листья; B – ювенильные растения.

3 Взаимодействие двух аллелей в локусе устойчивости (R r) и двух аллелей в локусе вирулентности (V v) Ген вирулентности Ген устойчивости R-rr V- vv Важнейшие для селекции следствия из теории Флора Сорта, защищенные единичными генами устойчивости, должны быстро терять устойчивость, т.к. достаточно мутации одного гена патогена для его превращения из авирулентного в вирулентный Необходим постоянный поиск новых генов устойчивости В селекции следует использовать не просто устойчивые образцы, а носители конкретных эффективных генов устойчивости.

4 Индукция устойчивости к листовой ржавчине под действием бензимидазола Система взаимодействияИзучено образцов Устойчивы в бензимидазоле Устойчивы интактно % ошибочной классификации Мягкая пшеница – P. triticina Ae. tauschii – P. triticina Ae. cylindrica – P. triticina Тритикале – P. triticina Твердая пшеница – P. triticina Ячмень – Blumeria graminis Ячмень – Bipolaris sorokiniana Выделение источников устойчивости

5 Образец Обозначение гена устойчивости Тип реакции при заражении интактных растений отрезков листьев на бензимидазоле к LrM 2 30 к LrM 4 30 к LrM 3 30 и один ген30 и один ген30 HD 2307один ген30 FrederickLrFred1, Lrfred230 TAM 106LrCo1, Lrfred2, Lrpar30 ParkerLrpar30 Parker 5LrCo1, Lrpar30 Co LrCo1, LrCo330 Co LrCo1, Lrco230 F 2 H-296LrCo1, Lrpar30 Purdue 6693LrPur1, Lrpur230 к LrM 6 3е.п. HarihikariLrH30 Тип реакции на заражение сборной популяцией P. recondita образцов пшеницы, имеющих по литературным данным новые эффективные гены ювенильной устойчивости

6 Сравниваемые сборы (образец, дата) rI ПФ ВИР, 2007 г. Саратовская 29, – Саратовская 29, ,7145,62 ДОС ВИР, 2007 г. Siete Cerros, – Siete Cerros, ,8048,61 ДОС ВИР, 2008 г. к-23731, – к-23731, ,7470,06* к-31474, – к-31474, ,8348,03 ПФ ВИР, 2008 г. к-28683, – к-28683, ,7179,05* к-48548, – к-48548, ,7680,32* Критерии сходства (r) и идентичности (I) для сборов клонов P. triticina с одного образца пшеницы

7 Сбор (образец, дата) Частота клонов, вирулентных к линиям пшеницы с геном устойчивости Lr1Lr2aLr26Lr23Lr20Lr19 ДОС ВИР, 2007 г. Siete Cerros, ,320,460,210,490,510,06 Siete Cerros, ,530,600,410,800,640,10 td 2,99**2,02*3,08**4,98**1,791,16 ПФ ВИР, 2007 г. Саратовская 29, ,410,350,410,620,450,05 Саратовская 29, ,370,300,360,820,770,04 td 0,530,660,623,20**4,94**0,31 ДОС ВИР, 2008 г к-31474, ,400,520,360,790,530,15 к-31474, ,610,700,400,880,660,17 td 4,35**3,89**0,842,55*2,8**0,40 Характеристика по вирулентности субпопуляций P. triticina, собранных с одного образца пшеницы в разные сроки

8 АНАЛИЗ РОДОСЛОВНЫХ 1. Аутентичность изучаемого образца. 2. Знание реакции на заражение патогеном всех генотипов, входящих в родословную. 3. Только уже известные гены устойчивости могут контролировать признак у изучаемых образцов.

9 ГИБРИДОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ Количество генов устойчивостиСоотношение растений устойчивыевосприимчивые 1 доминантный ген 31 1 рецессивный ген 13 Некумулятивная полимерия 2 доминантных гена рецессивных гена 79 2 гена, один рецессивный и 1 доминантный доминантных гена рецессивных гена гена, один рецессивный и 2 доминантных гена, один доминантный и 2 рецессивных 559 Комплементарное взаимодействие генов 2 доминантных гена 97 2 рецессивных гена гена, один рецессивный и 1 доминантный доминантных гена рецессивных гена гена, один рецессивный и 2 доминантных гена, один доминантный и 2 рецессивных 361 Один независимый и 2 комплементарных гена 1 доминантный и 2 комплементарных доминантных доминантный и 2 комплементарных рецессивных доминантный и 2 комплементарных – доминантный и рецессивный рецессивный и 2 комплементарных доминантных рецессивный и 2 комплементарных рецессивных рецессивный и 2 комплементарных – доминантный и рецессивный 2539

10 Число и характер взаимодействия генов устойчивости Соотношение семей R*R*RSS Один ген 121 Два гена, некумулятивная полимерия 781 Два гена, комплементарность 187 Три гена, некумулятивная полимерия Три гена, комплементарность Три гена, два комплементарных и один независимый Ожидаемые расщепления по устойчивости в F 3 от скрещивания устойчивого и восприимчивого к ржавчине родителей. * R – устойчивые семьи; S – восприимчивые семьи; RS – семьи, расщепляющиеся по устойчивости

11 Количество генов устойчивости Значение 2 факт. 1 доминантный ген 0,03 Некумулятивная полимерия 2 доминантных гена 61,89 2 гена, один рецессивный и 1 доминантный доминантных гена 373,90 3 гена, один рецессивный и 2 доминантных 95,80 3 гена, один доминантный и 2 рецессивных 9,67 Комплементарное взаимодействие генов 2 доминантных гена 17,02 3 доминантных гена 51,04 Один независимый и 2 комплементарных гена 1 доминантный и 2 комплементарных доминантных 20,42 1 доминантный и 2 комплементарных рецессивных 0,05 1 доминантный и 2 комплементарных – доминантный и рецессивный 1,10 1 рецессивный и 2 комплементарных доминантных 3,62 2 рецессивных и 2 комплементарных доминантных 0,01 Значения 2 для гипотез генетического контроля устойчивости к ржавчине образца MN по результатам расщепления в F 2 от скрещивания с Мильтурум 7526

12 Количество генов устойчивости Значение 2 факт. 1 ген гена Три гена, два комплементарных и один независимый 8.34 Четыре гена, два независимых и 2 комплементарных Значения 2 для гипотез генетического контроля устойчивости к ржавчине по результатам расщепления в F 3 от скрещивания MN × Мильтурум 7526 Идентификация гена Скрещивание изучаемого образца с носителями конкретных генов устойчивости F 2 MN × Scua 213 R : 0 S

13 Ген Lr13 Образцы пшеницы ThLr13 Клон патогена Если опытный образец устойчив ко всем независимо выделенным авирулентным к конкретному гену устойчивости изолятам, то он имеет этот ген резистентности; в случае восприимчивости хотя бы к одному из этих изолятов надежно постулируется отсутствие данного гена у образца. Фитопатологический тест

14 Клон 1 Клон 2 Образец 1 + – Образец 2 – + 1.Различные гены устойчивости 2. Разные аллели одного гена устойчивости 3. Один идентичный ген устойчивости + различные гены устойчивости Тест на аллелизм 1.Строго доказано, что 2 образца имеют по одному гену устойчивости к конкретному инокулюму 2. Отсутствует расщепление в F 2 от их скрещивания 3.Дифференциальная реакция на клоны патогена.

15 Рис. 2. Схема Полимеразной цепной реакции (ПЦР)

16 Аллель устойчивости Продукт амплификации Аллель восприимчивости Продукт амплификации Нет Рис.3 Схема идентификации гена устойчивости с использованием ПЦР ДНК маркера

17 Преимущества 1. срок идентификации 2. отсутствие супрессии 3. независимость от внешних условий 4. большое количество маркеров ().

18 Гены устойчивости пшеницы к листовой ржавчине, для которых разработаны ПЦР ДНК маркеры (по McIntosh et al, 2008) Lr1, Lr3, Lr9, Lr10, Lr13, Lr14a, Lr16, Lr19, Lr20, Lr21, Lr22, Lr24, Lr25, Lr26, Lr28, Lr29, Lr32, Lr34, Lr35, Lr37, Lr39, Lr46, Lr47, Lr50, Lr51, Lr52, Lr57, Lr58.

19 Публикации, в которых идентификация генов устойчивости пшеницы к листовой ржавчине осуществлена только по результатам анализа ПЦР ДНК маркеров Гайнуллин Н.Р., Лапочкина И.Ф., Жемчужина А.И., Киселева М.И., Коломиец Т.М., Коваленко Е.Д. Использование фитопатологического и молекулярно-генетического методов для идентификации генов устойчивости к бурой ржавчине у образцов мягкой пшеницы с чужеродным генетическим материалом // Генетика Т. 43. С Гультяева Е.И., Канюка И.А., Алпатьева Н.В., Баранова О.А., Дмитриев А.П., Павлюшин В.А. Молекулярные подходы в идентификации генов устойчивости к бурой ржавчине у российских сортов пшеницы // Доклады РАСХН С Дженин С.В., Лапочкина И.Ф., Жемчужина А.И., Коваленко Е.Д. Доноры устойчивости яровой мягкой пшеницы к бурой ржавчине и мучнистой росе с генетическим материалом видов Aegilops speltoides L., Aegilops triuncialis L., Triticum kiharae Dorof. et Migusсh. //ДокладыРАСХН N 5. С Урбанович О.Ю., Малышев С.В., Долматович, Картель Н.А. Определение генов устойчивости к бурой ржавчине в сортах пшеницы (Triticum aestivum L.) с использованием молекулярных маркеров // Генетика V. 42. С Stepien L., Golka L., Chelkowski J. Leaf rust resistance genes of wheat: identification in cultivars and resistance sources // J. Appl. Genet V. 44. P Greganova Z., Kraic J., Galova Z. Diagnostic of wheat leaf rust resistance genes by DNA markers and their application in mas // Czech J. Genet. Plant Breed. – – V.39. – P.127–129. Wioeniewska H., Stкpieс Ј., Kowalczyk K. Resistance of spring wheat cultivars and lines to leaf rust // J. Appl. Genet. 44(3), 2003, P Singh R., Tiwari R., Datta D. Detection of Leaf Rust Resistance Genes Lr9 and Lr10 in Wheat (Triticum aestivum) by PCR Based STS Markers //Acta Phytopath et Ent. Hungarica V. 38. P Babar M., Mashhadi A.F., Mehvish A. et al. Identification of rust resistance genes Lr10 and Sr9a in Pakistani wheat germplasm using PCR based molecular markers //African Journal of Biotechnology Vol. 9(8), pp

20 Аллель устойчивости Мутации аллель устойчивости + аллель устойчивости – маркер – маркер + Рекомбинация аллель устойчивости + аллель устойчивости – маркер – маркер + Рис.4 Возможные механизмы нарушения связи наличия аллеля устойчивости и ПЦР ДНК маркера

21 Аллель устойчивости Мутации аллель устойчивости + аллель устойчивости – маркер – маркер + Рекомбинация аллель устойчивости + аллель устойчивости – маркер – маркер + Рис.5 Возможные механизмы нарушения связи наличия аллеля устойчивости и ПЦР ДНК маркера

22 М М Рис. 6. Продукты амплификации с использованием праймеров J 13 к STS локусу, сцепленному с геном устойчивости Lr9. М – маркер молекулярного веса, 1 – АНК-4, 2 – Гарасовскя 5, 3 – Зоя, 4 – Квинта, 5 – Киевская, 6 – Cep 14 –Tapes, 7– Thatcher п.о. Абсолютное совпадение результатов идентификации гена устойчивости мягкой пшеницы к листовой ржавчине с помощью ПЦР ДНК маркера, гибридологического анализа и фитопатологического теста

23 Таблица 1. Характеристика образцов, выделенных как имеющих ген Lr9, по устойчивости к листовой ржавчине и наличию амплифицированного фрагмента STS маркера J13. Образец Тип реакции на заражение, инокулюм Наличие фрагмента амплификации популяция клоны, вирулентные к гену Lr9 ThLr903+ АН АНК-403+ Гарасовская 503+ Дуэт03+ Зоя03+ Линия F6BC5 555/1503+ Лютесценс Удача03+ GKB-103+ TR/55P

24 Рис. 7 Продукты амплификации с использованием праймеров J09 к STS локусу, сцепленному с геном устойчивости Lr24. М – маркер молекулярного веса, 1 – N89L, 2 – Siouxland 89, 3 – Parker 76, 4 – Arapohoe, 5 – Лавина, 6 –Stoa, 7 – STW , 8 – Torres, 9 – PS 131, 10 – PS 133, 11 – Scua, 12 – BR- 34, 13 – PF 84316, 14 – Sunco, 15 – Thatcher. М М 310 п.о. Не полное совпадение результатов идентификации гена устойчивости с помощью ДНК маркера, гибридологического анализа и фитопатологического теста

25 Образец Тип реакции на заражение, инукулюм Наличие STS маркера популяцияклоны, вирулентные к Lr24 Th Lr2400, 3+ Лавина03+ Arapohoe03+ Collin03+ Gus03+ Norkan03+ Parker Siouxland SST Stoa03+ STW Tules03+ BR Scua03- Torres03- Century03- Cimmaron03- MN OC Таблица 2. Характеристика образцов, выделенных как имеющих ген Lr24, по устойчивости к листовой ржавчине и наличию амплифицированного фрагмента STS маркера J9.

26 Не совпадение результатов идентификации генов устойчивости с помощью ДНК маркеров и фитопатологического теста образцы, для которых выявлено не совпадение отмечены красным) Сорт, образец Ген устойчивости по результатам STS анализа Клон DoublecropLr ХазаркаLr RoblinLr OmegaLr PasquaLr HopeLr ПрохоровкаLr РодинаLr Тэтчер ThLr Таблица 3. Типы реакции сортов мягкой пшеницы на заражение клонами P. triticina, авирулентными к гену устойчивости Lr1

27 Сорт, образец Ген устойчивости по результатам STS анализа Клон ЗаряLr OmegaLr201-2 PlanetLr Тэтчер ThLr Таблица 4. Типы реакции сортов мягкой пшеницы на заражение клонами P. triticina, авирулентными к гену устойчивости Lr20 Сорт, образец Ген устойчивости по результатам STS анализа Клон EquinoxLr ХазаркаLr ProspectLr ПрохоровкаLr Тэтчер ThLr Таблица 5. Типы реакции сортов мягкой пшеницы на заражение клонами P. triticina, авирулентными к гену устойчивости Lr26

28 Таблица 6. Типы реакции сортов мягкой пшеницы на заражение клонами P. triticina, авирулентными к гену устойчивости Lr10 Сорт, образецГен устойчивости по результатам STS анализа Клон 1234 PikoLr BrigadierLr100;0;303 VanceLr100;033 Lerma Rojo 64Lr100;330 RendezvousLr100;233 ProspectLr AC DomainLr LeguanLr HopeLr ПрохоровкаLr СаррубраLr RoblinLr Харьковская 26Lr Манна 2Lr АнгелинаLr Мильтрум 63Lr Эскада 70Lr МаринкаLr Мальцевская 110Lr ЭстерLr Воронежская 16Lr РодинаLr ThLr100000

29 Сорт, образец Ген устойчивости по результатам SSR анализа Клон 1234 Lerma Rojo 64Lr34X333 ЗаряLr ManitouLr340; PasquaLr340; DoublecropLr AC DomainLr340; RoblinLr340; Тэтчер3333 ThLr340; Таблица 7. Типы реакции сортов мягкой пшеницы на заражение клонами P. triticina, авирулентными к гену устойчивости Lr34

30 100 п.о. М Р и с. 8 Продукты амплификации с использованием праймеров WMS130 к SSR локусу Xgwm130, сцепленному с геном устойчивости Lr34 М – маркер молекулярного веса, 1 – Thatcher Lr13, 2 – Chris, 3 – Neepawa, 4 – Thatcher Lr10, 5 – Mayo 54, 6 – Mayo 52, 7 – Эскада 70, 8 – Hope, 9 – Piko, 10 – Rendezvouz, 11 – Prospect, 12 – Прохоровка, 13 – Эстер, 14 – Родина, 15 – Thatcher Lr34, 16 –Doubleсrop, 17 – Lerma Rojo 64, 18 – Roblin, 19 – Заря, 20 – Manitou, 21 – Pasqua, 22 – Thatcher. Т а б л и ц а 8. Типы реакции отрезков листьев образцов пшеницы на инокуляцию монопустульными изолятами P. recondita f.sp. tritici Образец Номер монопустульного изолята 12 ThLr340; Doublecrop33 Lerma Rojo 6433 Mayo 5233 Mayo 5433 Prospect33 Rendezvous30 Эскада 7033 Эстер33 Thatcher33

31 300 п.о. М Р и с. 9 Продукты амплификации с использованием праймеров к STS локусу F12245, сцепленному с геном устойчивости Lr10 М – маркер молекулярного веса, 1 – Thatcher Lr13, 2 – Chris, 3 – Neepawa, 4 – Thatcher Lr10, 5 – Mayo 54, 6 – Mayo 52, 7 – Эскада 70, 8 – Hope, 9 – Piko, 10 – Rendezvouz, 11 – Prospect, 12 – Прохоровка, 13 – Эстер, 14 – Родина, 15 – Thatcher Lr34, 16 –Doubleсrop, 17 – Lerma Rojo 64, 18 – Roblin, 19 – Заря, 20 – Manitou, 21 – Pasqua, 22 – Thatcher. Т а б л и ц а 9. Типы реакции отрезков листьев образцов пшеницы на инокуляцию монопустульными изолятами P. recondita f.sp. tritici Образец Номер монопустульного изолята 12 ThLr1000 Piko33 Rendezvous33 Заря33 Родина33 Эскада 7033 Thatcher33

32 НЕ СОВПАДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИДЕНТИФИКАЦИИ ГЕНОВ УСТОЙЧИВОСТИ Lr 9 и 24 У ОБРАЗЦОВ AEGILOPS UMBELLULATA И ЛИНИЙ МЯГКОЙ ПШЕНИЦЫ С ЧУЖЕРОДНЫМИ ТРАНСЛОКАЦИЯМИ С ПОМОЩЬЮ ДНК МАРКЕРОВ, И ФИТОПАТОЛОГИЧЕСКОГО ТЕСТА

33 Номе каталога либо интродукции ВИР Тип реакции на заражение P. triticinaНаличие маркера размером 1100 п.о. популяцияклоны, вирулентные к Lr Таблица 10. Характеристика образцов Aegilops umbellulata по устойчивости к листовой ржавчине и наличию амплифицированного фрагмента STS маркера J п.о. 850 п.о. Рис. 11 Продукты амплификации с использованием праймеров J 13 к STS локусу, сцепленному с геном устойчивости Lr9. М – маркер молекулярного веса, 1 – к-1283, 2 – Thatcher, 3 – ThLr9, 4 – к-2029, 5 – и , 6 – к-1461, 7– и , 8 – и , 9 - и М

34 Образец, линия Устойчивость от Идентифицированные гены устойчивости методом ПЦР-анализа Наличие вирулентных клонов P. triticina Lr 9Lr 24 76/00Ae. speltoides+-+ 79/00Ae. speltoides /00T. kiharae /00T. kiharae /00-1Ae. triuncialis-++ k-1652Ae. triuncialis+-+ Гайнуллин и др., Дженин и др., Таблица 11. Характеристика образцов мягкой пшеницы с чужеродным генетическим материалом по наличию ДНК маркеров и вирулентных клонов возбудителя листовой ржавчины

35