ВЛИЯНИЕ ФИБРИЛЛЯРНЫХ АГРЕГАТОВ И ОЛИГОМЕРОВ ЛИЗОЦИМА НА СТУКТУРНОЕ СОСТОЯНИЕ И СВОЙСТВА МОДЕЛЬНЫХ МЕМБРАН Касторная Анна Петровна Научный руководитель: доктор физ.-мат. наук, профессор Горбенко Галина Петровна

Актуальность Множество патологий (болезни Альцгеймера, Паркинсона, диабет II типа и др.) обусловлены отложением в различных органах и тканях упорядоченных агрегатов специфических белков (амилоидных фибрилл) В основе цитотоксического действия амилоидных белков лежат взаимодействия этих соединений с мембраной. Выяснение молекулярных механизмов, лежащих в основе самосборки белковых агрегатов и их биологической активности. Амилоидные фибриллы Chamberlain et al. (2000) Biophys. J.,79,

Цель работы Исследование влияния фибриллярных агрегатов и олигомеров лизоцима на структуру и физико- химические свойства модельных липидных мембран (липосом)

Амилоидные фибриллы - упорядоченные агрегаты неправильно свернутых белков Образование неспецифических ионных каналов Образование неспецифических ионных каналов Изменение внутриклеточного уровня свободного кальция Изменение внутриклеточного уровня свободного кальция Захват липидов в растущие фибриллы Захват липидов в растущие фибриллы

Однослойные липосомы Фосфатидилхолин (ФХ)Кардиолипин (КЛ) Полярная голова Гидрофобный хвост 100 нм

Флуоресцентные зонды 1,6-дифенил-1,3,5-гексатриен (ДФГТ) Пирен Локализуются в гидрофобной области мембраны 3-метоксибензантрон (МБА) 4-диметиламинохалкон (ДМХ) Лаурдан Располагаются на границе раздела липид-вода

I. Изучения действия фибриллярного лизоцима на липидный бислой 1. Анализ спектров флуоресценции Лаурдана Параметр обобщенная поляризация (GP) содержит информацию о процессах релаксации диполей растворителя, происходящих за то время, пока Лаурдан находится в возбужденном состоянии, и, следовательно, отражает степень гидратации бислоя. Амилоидные фибриллы вызывают уменьшение полярности (уровня гидратации) бислоя и увеличение плотности упаковки липидов.

2. Измерение анизотропии флуоресценции ДМХ, МБА и ДФГТ Анизотропия флуоресценции характеризует степень вращательной диффузии зонда, которая зависит от вязкости микроокружения зонда в мембране. ДМХ МБА ДФГТ Возрастание анизотропии флуоресценции свидетельствует об уменьшении подвижности зонда в липидном бислое в присутствии амилоидных фибрилл и, следовательно, об увеличении жесткости мембраны.

Спектры флуоресценции пирена в липосомах ФХ:КЛ (10%) Экспериментально показано, что отношение вибронных полос пирена I I /I III зависит от полярности микроокружения зонда. 3. Анализ вибронной структуры спектров флуоресценции и степени эксимеризации пирена Отношение интенсивностей флуоресценции эксимеров к интенсивности флуоресценции мономеров (Е/М) отражает степень эксимеризации пирена и зависит от частоты столкновений молекул зонда. Состав липосомКонтрольВ присутствии лизоцима 0.96 мкМ I I /I III Е/МI I /I III Е/М ФХ 0.95 ± ± ± ± 0.02 ФХ:КЛ (10%) 0.96 ± ± ± ± 0.03 Неизменность величин I I /I III и Е/М при добавлении фибриллярного лизоцима свидетельствует об отсутствии влияния амилоидных фибрилл на структурное состояние гидрофобной области мембраны.

II. Исследование влияния олигомерных форм лизоцима на модельные мембраны 1. Обобщенная поляризация флуоресценции Лаурдана как функция от концентрации олигомеров лизоцима А: ФХ – 6 мкМ, Б: ФХ – 58 мкМ, В: ФХ/КЛ (20%) – 6 мкМ, Г: ФХ/КЛ (20%) – 58 мкМ. А Б В Г Наблюдается зависимость эффекта от состава мембран и молярного соотношения липид-белок.

2. Исследование влияния олигомеров лизоцима с помощью измерения анизотропии флуоресценции ДФГТ Состав липосом ФХФХ/КЛ (20%) День инкубации в этаноле А ± А КонтрольВ присутствии лизоцима 4.1 μМ КонтрольВ присутствии лизоцима 4.1 μМ ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± Результаты измерения при молярном соотношении липид-белок 1.5 Во всех случаях наблюдается возрастание анизотропии флуоресценции ДФГТ

Состав липосом ФХФХ/КЛ (20%) День инкубации в этаноле А ± А КонтрольВ присутствии лизоцима 4.1 μМ КонтрольВ присутствии лизоцима 4.1 μМ ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± Результаты измерения при молярном соотношении липид-белок 14.5 ! При больших концентрациях липида анизотропия увеличивается только в липисомах, содержащих КЛ, а в ФХ липосомах остается постоянной. Возрастание анизотропии при добавлении олигомеров лизоцима свидетельствует о том, что амилоидный белок вызывает уменьшение вязкости микроокружения ДФГТ.

Выводы 1.Методом флуоресцентной спектроскопии исследовано влияние олигомерных агрегатов и зрелых амилоидных фибрилл лизоцима на разные области липидного бислоя. Измерение анизотропии флуоресценции ДФГТ, а также анализ вибронной структуры спектров флуоресценции пирена и оценка степени эксимеризации пирена показали отсутствие влияния фибриллярного белка на жесткость и полярность бислоя в области углеводородных цепей, независимо от состава мембран. 2.Структурная модификация модельных мембран на границе раздела липид-вода под влиянием амилоидных фибрилл лизоцима была изучена с помощью флуоресцентных зондов Лаурдана, ДМХ и МБА. Как в чисто ФХ липосомах, так и в липосомах, содержащих КЛ, наблюдалось возрастание обобщенной поляризации флуоресценции Лаурдана на ряду с увеличением анизотропии флуоресценции ДМХ и МБА, что было объяснено уменьшением уровня гидратации бислоя и увеличением плотности упаковки липидов в мембране.

3.Влияние олигомеров лизоцима было исследовано с помощью флуоресцентных зондов с различной локализацией в бислое – Лаурдана и ДФГТ. В присутствии олигомеров лизоцима обнаружено увеличение анизотропии флуоресценции ДФГТ, а также возрастание GP флуоресценции Лаурдана в ФХ липосомах только при низких значениях молярного соотношения липид-белок, равном 1.5, в отличие от липосом, состоящих из ФХ и 20 мол. % КЛ, в которых описанные эффекты были обнаружены и при более высоком значении этого соотношения, равном 14.5.

Получение липосом методом экструзии Мульти- ламеллярные везикулы Поликарбонатный фильтр с диаметром пор 100 нм Униламеллярные везикулы

Флуорофоры преимущественно поглощают те фотоны, электрические векторы которых направлены параллельно моменту перехода флуорофора. При возбуждении поляризованным светом селективно возбуждаются те молекулы флуорофора, для которых дипольный момент перехода при поглощении параллелен электрическому вектору возбуждающего света. Излучаемый зондом квант флуоресценции также поляризован. Измерения поляризации или анизотропии выявляют среднее угловое смещение флуорофора, которое происходит между поглощением и последующим испусканием фотона. Оно зависит от скорости и степени вращательной диффузии за время жизни возбужденного состояния. Диффузионные движения в свою очередь зависят от вязкости микроокружения зонда в мембране.

Факторы, способствующие агрегации белка: Изменение рН, температуры, смена растворителя Специфические мутации Взаимодействия с ионами металлов Химические модификации (окисление, протеолиз) Амилоидные фибриллы Chamberlain et al. (2000) Biophys. J.,79, Белок в нативном состоянии Упорядоченные префибриллярные агрегаты

Структура амилоидных фибрилл Структура протофиламентов образована бета-листами, параллельными продольной оси фибриллы, в то время как бета-шпильки перпендикулярны этой оси. Фибриллы обычно состоят из переплетенных между собой протофиламентов, каждый из которых 2-5 нм в диаметре.

Исследование эксимеризации пирена При столкновении двух молекул пирена – возбужденной и невозбужденной образуются эксимеры, которые обладают собственной флуоресценцией в области 470 – 480 нм. П + hν п П* + П (ПП*) Cтепень эксимеризации пирена характеризуется отношением Е/М = I 466 /I 391, которое зависит от наличия свободного объема бислоя. Изучение спектральных свойств пирена является информативным методом исследования изменения плотности упаковки липидов в мембране.

полярность Локализация зонда в бислое

Источник света (ксеноновая дуговая лампа) Монохроматор возбуждения с двумя решетками Затвор Держатель фильтра ФЭУ Поляризатор Кюветное отделение оптический модуль Ячейка сравнения ФЭУ Управляющее устройство для монохроматора Компьютер Вывод данных Монохроматор испускания