Электрический пробой при перекисном окислении липидов Кафедра медицинской биофизики Российского Государственного Медицинского Университета

R (сопротивление) БЛМ = 10 7 – 10 8 Ом*см 2 Слой раствора электролита (KCl 0.01 М) имеет R = 10 – 4 Ом*см 2 5 нм (50 А) диэлектрическая проницаемость) липидов мембраны 2 диэлектрическая проницаемость) воды = 80 Если концентрация ионов в растворе равна 0.1 М, то в липидной фазе она должна упасть до М. Электрические свойства Бислойной Липидной Мембраны (БЛМ)

Изучение электрического пробоя на БЛМ

ABCD Е 5 нм (50 А) BLM - Bilayer Lipid Membrane A – C – стадии формирования БЛМ. D – микроскопическое строение БЛМ. E – Общий вид установки с БЛМ. Формирование бислойной липидной мембраны

Вольт-амперные характеристики БЛМ Ток (пА) Разность потенциалов (мВ) + 20% холестерина + УФ контроль При потенциалах, ниже порогового значения *, зависимость между током и разностью потенциалов на мембране – линейная. При потенциалах выше * ток начинает расти. Процесс прогрессирует во времени и, если не сбросить потенциал, заканчивается механическим разрушением мембраны. Такое явление называется электрическим пробоем мембраны. Потенциал *называется потенциалом пробоя и может служить количественной характеристикой электрической прочности мембран.

Гипотезы механизма электрического пробоя

Неспецифическая проницаемость для разных низкомолекулярных веществ; Локальность изменения свойств мембраны; Резкое увеличение флип-флопа липидов при электропермеабилизации; Существование легко измеряемого эффективного диаметра проницаемых структур, который зависит от параметров электрообработки. Факты в пользу теории порообразования

Зависимость времени жизни липидных пор от напряжения (теория и эксперимент) (V) ,20,40,6 ФХ + лизоФХ ФЭ ФХ Lg, мкс Точками обозначены данные эксперимента, сплошные кривые– теоретические. Мембраны были сформированы из разных фосфолипидов: ФЭ - фосфатидилэтаноламин; ФХ - фосфатидилхолин. - Время жизни пор; - потенциал на мембране,

Пробой БЛМ при УФ облучении БЛМ из липидов митохондрий БЛМ из яичного лецитина УФ Сопротивление БЛМ, ГОм Время инкубации, мин

Время (мин) pH = 1.2 pH = 3.2 (мВ) Потенциал пробоя Измерение потенциала, генерируемого мембраной в результате диффузии ионов в присутствии переносчика протонов ClCCP. Запись изменения потенциала. После добавления ClCCP с одной стороны мембраны добавляли кислоту для создания разности рН ( pH). HCl (mV) Самопробой БЛМ протонным диффузионным потенциалом

Электрический пробой мембран собственным мембранным потенциалом 2 мин 1 мин 25 мВ замыкание Мембранный потенциал ClCCP замыкание 30 мВ Val * * Пробой Источником электродвижущей силы в данном случае служит сама мембрана, по сторонам которой созданы разные концентрации ионов: K + (слева) или H + (справа). Мембранный потенциал появлялся в ответ на введение ионофора: валиномицина (переносчик ионов калия) – слева или CCCP (переносчик протонов) – справа. Как только потенциал достигал критического значения, наступал электрический пробой и измеряемый потенциал начинал падать. В этот момент производилось "короткое замыкание" растворов по сторонам мембраны. После потенциал вновь развивался и вторично наступал электрический пробой мембраны (при потенциале пробоя *).

Стрелкой показано начало УФ-облучения. ф m, - потенциал, измеренный на мембране. Значение ф m при котором кривые резко идут вниз соответствуют потенциалу пробоя. Потенциал пробоя уменьшается с увеличением продолжительности действия (дозы) УФ- излучения. При высоких дозах пробой наблюдается даже при очень низких потенциалах. Электрический пробой БЛМ при действии УФ- индуцируемой пероксидации

Пробой БЛМ при разном диффузионном потенциале Две величины - величина потенциала пробоя и время жизни мембраны тесно связаны. Если величина потенциала пробоя достаточно высока, то мембрана быстро разрушается. Если создаваемый диффузионный потенциал низок, то мембрана может жить дольше, но все равно разрушается, если этот потенциал не снять.

Изучение электрического пробоя на липосомах

Светопропускание Электрический пробой мембран липосом +KAc Ac – H + pH H + KAc Пробой +ClCCP Время Изменения светопропускания суспензии липосом при добавлении ацетата калия (KAc) и протонофора (CCCP). Липосомы (0.2 мг/мл) были получены из яичного лецитина в растворе сахарозы (10 mmol/I). Добавки ацетата: а - 5 мМ, б - 15 мМ, в - 40 мМ. Ко всем пробам добавляли валиномицин до концентрации 100 нМ. В результате вхождения уксусной кислоты и ионов калия внутрь липосомы, на мембране создается равновесный калиевый потенциал. При определенном потенциале мембрану пробивает, концентрации ацетата выравниваются и светопропукание суспензии резко подскакивает.

Lg([Kac] o / [Kac] i набухание сжатие T/T (отн. ед.) Мембранный потенциал Изменение светопропускания суспензии липосом при добавлении протонофора к липосомам, нагруженным KAc (справа) или помещенным в раствор KAc (слева). [KAC] i и - [KAC] o - концентрация ацетата внутри и снаружи липосом, соответственно. Вверху рассчитанный мембранный потенциал. Ордината изменение светопропускания суспензии ( T/T) в ответ на добавление ионофора. Электрический пробой мембран липосом

Липосомы (0.2 мг липидов/мл) были изготовлены из смесли фосфолипидов митохондрий печени крысы с холестерином. Влияние холестерина на электрическую стабильность мембран липосом

Липосомы приготовлены из лецитина яичного желтка, сформированы в растворе сахарозы, содержащем различные концентрации детергента. 1 – додецилсульфат натрия (SDS), 2 – цетилтриметиламмоний бромид (СТАВ), З - Triton X-100. Влияние детергентов на потенциал пробоя мембран липосом

Уменьшение электрической стабильности мембран липосом (из яичного лецитина) при действии УФ- облучения (а) и при добавлении водорастворимых продуктов перекисного окисления (WSP) (b). WSP были выделены из супернатанта при центрифугировании (100,000 x g) липосом, предварительно облученных УФ ( нм). Влияние УФ и продуктов перекисного окисления на потенциал пробоя

Изучение электрического пробоя мембран митохондрий

2 мин U (mV) F (r.u.) субстрат ацетат Электрический пробой мембран митохондрий При добавлении к митохондриям субстратов появляется мембранный потенциал ( ). При добавлении ацетата уксусная кислота проникает в матрикс, уменьшая pH на мембране и тем самым увеличивая (левая кривая). Этот потенциал стабилен. Если добавить больше ацетата, вырастет сильнее, но он не держится (правая кривая).Величина tg на правой кривой характеризует утечку ионов через мембрану, пробитую слишком высоким потенциалом

o 1 2 d / dt Мембранный потенциал (мВ) Концентрация ацетата калия (мМ) Зависимость скорости падения мембранного потенциала от концентрации добавленного ацетата и мембранного потенциала в митохондриях KAc KCl Точка перелома на кривой с KAc соответствует началу пробоя мембраны и может рассматриваться как потенциал пробоя *. На рисунке также видно, что добавление KCl вместо KAc не приводит к пробою мембраны.

перекисное окисление липидов действие эндогенных фосфолипаз адсорбция на поверхности мембраны заряженных полиэлектролитов осмотическое растяжение мембраны Факторы, влияющие на электрическую стабильность мембран 1 - контроль (без воздействия); 2 – опыт.

Порочный круг в липидном слое при пероксидации Перекисное окисление липидов Самопробой мембраны Повышение температуры в точках пробоя Снижение потенциала пробоя Повреждение Ca 2+ -АТФазы Потеря свойства барьера Рост Ca 2+ в клетке

Электрические потенциалы (мВ) на мембранах клеток и потенциалы пробоя модельных и биологических мембран (А. В.Путвинский, Т. В. Пучкова, О. М.Парнев, Ю. А. Владимиров) Объект Разность потенциалов на мембране в клетках Потенциал пробоя Липидный бислой – 170 (БЛМ) Клеточная мембрана 70 (нервные и мышечные клетки) 90 – 100 (эритроциты) Внутренняя мембрана митохондрий 175 (митохондрии печени в присутствии субстратов и кислорода) 200

Загрузка клеток лекарственными препаратами Электрослияние клеток Генная трансформация клеток Стерилизация Электростимуляция Применение явления электрического пробоя

яйцо спермий яйцо мицеллы Модель слияния плазматических мембран в месте контакта спермия с яйцом

1. Физические факторы Величина приложенного потенциала Температура Высокочастотное электромагнитное поле Гидростатическое давление УФ облучение и перекисное окисление липидов 2. Качественный состав мембраны Фосфатидная кислота Лецитин Ганглиозиды Длина жирнокислотного остатка жирной кислоты 3. Химические соединения Глицерин Голотурин Полимиксин Влияние различных веществ и факторов на состояние мембраны

Влияние полимиксина на поверхностное натяжение

Вопросы к зачету 1.Электрический пробой плоской бислойной мембраны (БЛМ): формирование и свойства БЛМ. 2.Понятие электрического пробоя. Изучение пробоя клеточных мембран. Гипотезы о механизме электричского пробоя. 3.Принципы теории локальных пор Ю.А. Чизмаджева. Основные факты, подтверждающие теорию локальных пор. 4.Вольт-амперные характеристики БЛМ и условия электрического пробоя. 5.Влияние растяжения, липопероксидации и фосфолипазы на потенциал пробоя БЛМ. Факты и объяснение. 6.Вляиние электрического пробоя на электрическую стабильность мембран. 7.Самопробой БЛМ ионным диффузионным потенциалом. 8.Самопробой мембран при пероксидации липидов, индуцированной УФ излучением. 9.Принцип метода изучения электрического пробоя везикулярных липидных структур (липосом). 10.Электрический пробой мембран эритроцитов. Принцип метода, влияние растяжения мембраны, выход гемоглобина. 11.Электрический пробой митохондрий. Метод создания и измерения потенциала. Проявление пробоя. 12.Электрический пробой мембран при снижении поврехностного натяжения на границе раздела фаз.