Мембранные механизмы патологии клетки Моделирование гипоксического повреждения

Кислородный конус в участке ткани Область аноксии Область нормоксии Поток крови Поток кислорода

Условие повреждения митохондрий + Ca 2+ + O 2 – Ca 2+ + O 2 Митохондрии интактны + Ca 2+ – O 2 Митохондрии повреждены – Ca 2+ – O 2 интактны 20 мин инкубации при 37 о С

Степень повреждения Время инкубации, мин – O 2 + O 2 Без Ca За степень повреждения принята обратная величина коэффициента дыхательного контроля, по отношению к исходной в %, минус 100 % Время инкубации, мин – O 2 + O 2 В присутствии Ca 2+ 0 Степень повреждения % t RC Условия повреждения выделенных митохондрий Степень повреждения

Почему митохондрии повреждаются ионами Са 2+ в анаэробных условиях? А – Ca 2+ – O 2 – + Б – Ca 2+ + O 2 В Ca 2+ + Ca 2+ – O 2 – + Г + Ca 2+ + O 2 Д Фосфолипаза А 2 + Ca 2+ – O 2 – + Г + Ca 2+ + O 2

Накопление свободных жирных кислот (СЖК) и потеря дыхательного контроля (ДК) митохондриями при инкубации с ионами Ca Время инкубации (мин) Степень интактности (%) Свободные жирные кислоты (нм/мг белка) СЖК + O 2 – O 2 + O 2 ДК

Исходные Инкубация ЕГТА Cu 2+ совкаин ЖК СИ ЖК ЖК, нмоль / мг белка Влияние ингибиторов фосфолипазы А2 на на накопление СЖК и итактность митохондрий (СИ) Митохондрии печени крысы инкубировались 20 мин в отсутствие кислорода воздуха, но в присутствии 35 мкМ CaCl 2 (Инкубация). Там, где указано, к пробам добавляли ингибиторы фосфолипазы А 2 : 1 мМ ЕГТА, 1 мкМ Cu 2+ или 20 мкМ местного анестетика совкаина.

Влияние ингибиторов фосфолипазы А 2 на на накопление Ca 2+ и итактнссть митохондрий Исходные Гипоксия Гипоксия+ЭГТА ГО+1 мкМ Cu2+ 20 мкМ совкаин СЖК - содержание свободных жирных кислот СИ - степень интактности

Корреляция между содержанием СЖК и интактностью митохондрий СЖК (нм/мг белка) Степень интактности митохондрий (%)

Токсические вещества Перекисное окисление липидов Тканевая гипоксия Активация мембранных фосфолипаз Снижение уровня АТФ Усиленная активация рецепторов Повреждение мембранных структур клетки Увеличение содержания Са 2+ в цитоплазме Порочный круг в патологии клетки

Быстрый расход АТФ в переживающей печени (Hems Brosnam) Lactate ADP AMP ATP Nucleotides, nmoles/mg tissue Lactate, nmoles/mg tissue Time, min Rapid exhaustion of ATP in survived liver (Hems Brosnam) По абсциссе отложено время после прекращения доступа кислорода, по ординатам - концетрации АТФ, АДФ (слева) и лактата (справа).

Изменение количества Ca 2+ в митохондриях Время переживания органа при 24 о С (мин) Флуоресценция зонда (отн. ед.) Кусочки ткани Выделенные митохондрии

Последовательность нарушений в клетке при гипоксии Последовательность изменений в клетке в результате прекращения доступа кислорода (аноксии) одинакова для самых различных тканей. Это показали опыты со срезами тканей, изолированными клетками и изолированными клеточными органеллами, в частности митохондриями. В печени, находящейся в условиях аноксии при комнатной температуре, последовательность событий такова: О-5 мин аноксии: снижение уровня АТФ в клетке в 2-4 раза, несмотря на активацию гликолиза; 5-15 мин: появление Са +2 в цитоплазме клетки. Активация гидролитических ферментов, в том числе фермента фосфолипазы А 2 митохондрий. Содержание Са +2 в митохондриях повышается, т. к. они еще не повреждены (стадия 1 на рис. 3).стадия 1 на рис мин: гидролиз митохондриальных фосфолипидов фосфолипазой A 2 и нарушение барьерных свойств митохондриальной мембраны. Реоксигенация ткани на этой стадии приводит к активному набуханию митохондрий. Дыхательный контроль в митохондриях нарушен, окислительное фосфорилирование разобщено, способность митохондрий накапливать ионы кальция снижена (стадия 2 на рис. 3).стадия 2 на рис мин: частичное восстановление функций митохондрий, временное повышение дыхательного контроля, способности накапливать кальций. (стадия 3 на рис. 3) Механизм компенсаторных процессов, приводящих к временному улучшению функций митохондрий, неизвестен, но связан с функцией клетки в целом, так как при анаэробной инкубации изолированных митохондриий это явление не наблюдается;стадия 3 на рис. 3 более 90 мин: необратимое повреждение митохондрий и полная гибель клеток (стадия 4 на рис. 3).стадия 4 на рис. 3 При температуре тела человека все эти процессы протекают примерно в два раза быстрее; кроме того, в разных тканях они протекают с разной скоростью: быстрее всего в мозге, медленнее – в печени, еще медленнее – в мышцах.

Порочный круг клеточной патологии Увеличение внутриклеточного содержания кальция и нарушение биоэнергетических функций митохондрий являются общими признаками для клеток, поврежденных в результате действия самых различных неблагоприятных факторов. Эти два события – не простое следствие других изменений в поврежденных клетках: они лежат в основе нарушения функций поврежденных клеток и могут рассматриваться как главные звенья в цепи событий, приводящих к развитию неспецифической реакции клеток на повреждение. Схематически, взаимоотношение между первичным повреждением клеточных структур, процессами биоэнергетики и содержанием кальция в цитоплазме приведены на рис. 4.рис. 4

Порочный круг клеточной патологии Согласно этой схеме, первичными мишенями действия повреждающих агентов служат мембранные структуры клетки, в которых может подвергаться разрушению липидный бислой, рецепторы, белковые переносчики ионов и молекул (каналы), а также встроенные в мембраны ферменты, включая ионные насосы. Увеличение проницаемости мембран и подавление работы насосов, непосредственное вызванное действием повреждающих факторов (токсических соединений, свободных радикалов и продуктов липидной пероксидации, недостаток источника энергии – АТФ), приводят к увеличению концентрации натрия и кальция в цитоплазме. Последнее сопровождается дисбалансом внутриклеточной регуляции и активацией деструктивных ферментов, таких как фосфолипаза А 2 и эндонуклеазы. Гидролиз фосфолипидов мембран фосфолипазой приводит к дальнейшему нарушению барьерных свойств липидного бислоя, что приводит к еще большему росту уровня кальция в цитоплазме, набуханию митохондрий и их дальнейшему повреждению. Порочный круг замыкается и клетка скорее всего погибнет.

Влияние ингибиторов фосфолипазы А 2 на на накопление Ca 2+ и итактнссть митохондрий

Типичная кривая потребления кислорода митохондриями в различных состояниях 100 мкА О 2 1 мин Добавили митохондрии Добавили сукцинат V2V2 V3V3 V4V4 V5V5 Время инкубации суспензии без доступа кислорода Концентрация кислорода Закончилась АДФ Исчерпан кислород 0