Терапевтическое действие низкоинтенсивных лазеров как результат коррекции уровня свободных радикалов в нашем организме Терапевтическое действие низкоинтенсивных лазеров как результат коррекции уровня свободных радикалов в нашем организме Юрий Андреевич Владимиров Московский Государственный Универсистет 6 октября 2011г. 10:00 – 10:25 Владимиров Ю. А. Московский Государственный Университет

Обращение к читателю Глубокоуважаемый коллега: Используя данную презентацию, Вы должны соблюдать правила, оговоренные лицензией на сайте организации Сreative Сommons по адресу Согласно присвоенному каждому слайду данной презентации типу лицензии Attribution-NoDerivs ( Вы имеете право на использование слайдов данной презентации в учебных целях, коммерческом или не коммерческом, но только целиком, без всяких изменений и с указанием авторства, а также на распространение презентации на тех же условиях. Логотип Attribution-NoDerivs и указание автора размещены на каждом слайде и не могут быть оттуда удалены, равно как не допускасется какое-либо изменение самих слайдов. Владимиров Ю. А. Московский Государственный Университет

Глубокоуважаемый коллега: Используя данную презентацию, Вы должны соблюдать правила, оговоренные лицензией на сайте организации Сreative Сommons по адресу Согласно присвоенному каждому слайду данной презентации типу лицензии Attribution-NoDerivs ( Вы имеете право на использование слайдов данной презентации в учебных целях, коммерческом или не коммерческом, но только целиком, без всяких изменений и с указанием авторства, а также на распространение презентации на тех же условиях. Логотип Attribution-NoDerivs и указание автора размещены на каждом слайде и не могут быть оттуда удалены, равно как не допускасется какое-либо изменение самих слайдов.

На что может действовать лазерное излучение? фотонов Лазерное излучение – это поток света, т. е.поток фотонов. На что может действовать свет? Свет взаимодействуект с электронамиСвет может действовать только на молекулы, а точнее – на электроны. Электромагнитное поле действует преимущественно на самые легкие заряженные частицы материи - электроны. Свет взаимодействуект с электронами. Как действует свет на электроны? световое давление биологического эффекта дать не может 1.Фотоны обладают энергией и импульсом. Обладая импульсом, они оказывают световое давление на тела, которые отражают или рассеивают свет. Но действие это ничтожно по величине и никакого биологического эффекта дать не может. исчезнуть 2.Фотоны могут исчезнуть при взаимодействии с электронами в атомах и миолекулах, отдавая электронам свою энергию. Владимиров Ю. А. Московский Государственный Университет

Образование радикалов неспаренный электрон Свободный радикал - это молекулярная частица, у которой на внешней оболочке имеется хотя бы один неспаренный электрон. CO H H H радикал метанола Вот формулы некоторых других свободных радикалов O O H гидроперекисный радикал O O супероксид радикал ()-)- Владимиров Ю. А. Московский Государственный Университет

Радикалы в организме человека Первичные ПриродныеЧужеродные Вторичные ТретичныеРадиация Ультрафиолет, лазерное облучение Ксенобиотики СупероксидНитроксидСемихиноныГидроксилРадикалы липидов Радикалы антиоксидантов Радикалы воды и био- молекул Радикалы молекул- хромофоров Радикалы токсических веществ Владимиров Ю. А. Московский Государственный Университет

Основное положение биостимулирующего действияживые клетки Все известные нам факты биостимулирующего действия лазерного изучения на живые клетки, ткани и организмы являются следствием одной из двух основных первичных фотохимических реакций: 1)фотодинамического образования радикалов липидов в биологических мембранах и 2)2) фотолиза NO-комплексов гемопротеинов: (NO-гемоглобин и NO-цитохром с в синей и зеленой области спектра и NO- цитохромоксидаза в видимой и ближней ИК области). Владимиров Ю. А. Московский Государственный Университет

Что такое биостимулирующее действие? Пример биостимулирующего действия – активация фагоцитов при вхождении в клетку ионов кальция Malinin, V.S., Sharov, V.S., Putvinsky, A.V., Osipov, A.N. and Vladimirov, Y.A. (1989) Biochemistry and Bioenergetics Malinin, V.S., Kazarinov, K.D., Putvinsky, A.V., Vladimirov, Y.A. (1996) Membrane and Cell Biology 9(4), Малые дозы кальция, вошедшего в клетку, её стимулируют, а большие - её повреждают. Макрофаги Поры в мембране Владимиров Ю. А. Московский Государственный Университет

Биостимулирующее действие лазерного облучения (ГНЛ) Опсонизированный зимозан Стимул Без облучения Облучение Дозы, Дж/см 2 2 мин Klebanov, G.I., Teselkin Yu, O., Babenkova, I.V., Bashkujeva, T., Chichuk, T.V., Vladimirov Yu, A., Low-power laser irradiation induces leukocyte priming. Gen Physiol Biophys, (4): p Владимиров Ю. А. Московский Государственный Университет

Лазерное облучение вызывает вхождение ионов Ca 2+ в клетки Доза 0,25 Дж/см 2 Клебанов, Г.И., Чичук, Т.В., Владимиров, Ю.А., Влияние низкоинтенсивного лазерного излучения на пероксидацию мембранных липидов и концентрацию ионов кальция в цитозоле фагоцитов. Биологические мембраны, (1): p Ca 2+ Владимиров Ю. А. Московский Государственный Университет

Почему лазерное облучение вызывает вход ионов Ca 2+ в живые клетки? Ответ: 1.Лазерное облучение вызывает перекисное окисление липидов в мембранах клеток. 2.Перекисное окисление липидов блокирует кальциевые насосы и увеличивает проиницаемость мембран для кальция. Владимиров Ю. А. Московский Государственный Университет

Лазерное облучение приводит к перекисному окислению липидов в мембранах клеток Накопление продуктов липопероксидацииВывод: Продукты липопероксидации вызывают биостимуляцию лейкоцитов: увеличение ХЛ ответа на стимул. ХЛ ответ лейкоцитов Владимиров Ю. А. Московский Государственный Университет

Почему липопероксидация вызывает вхождение Ca 2+ в клетки? Ca 2+ ATP ADP Ca 2+ -ATФаза Клеточная мембрана Менее 10 –7 M Ca 2+ внутри клетки Более 10 –2 M Ca 2+ Снаружи Ca 2+ ATP ADP Каган, В.Е., Азизова, О.А., Архипенко, Ю.В., Клаан, Н.К., Козлов, Ю.П., Владимиров, Ю.А., Взаимосвязь структурных и функциональных перестроек в мембранах саркоплазматического ретикулума при перекисном окислении липидов. Биофизика, (4): p Владимиров Ю. А. Московский Государственный Университет

Почему лазерное облучение вызывает вход ионов Ca 2+ в живые клетки? Ответ: 1.Лазерное облучение вызывает перекисное окисление липидов в мембранах клеток. 2.Перекисное окисление липидов блокирует кальциевые насосы и увеличивает проиницаемость мембран для кальция. Владимиров Ю. А. Московский Государственный Университет

Обобщим полученные данные в виде схемы: Живая клетка (фагоцит) 2 Перекисное окисление липидов 3 Вход Ca 2+ в клетку Ca 2+ LASER Таинственный рецептор фотонов 4 Биостимуляция (прайминг) 1 Поглощение фотона Владимиров Ю. А. Московский Государственный Университет

Какое вещество служит первичным рецептором фотонов, излучаемых красным лазером (634 нм)? В красной области спектра (635 – 650 нм) поглощают свет главным образом три соединения, встречающиеся в обычных клетках, в том числе в лейкоцитах крови: 1)Ферментный комплекс дыхательной цепи митохондрий – цитохромоксидаза 2)Фермент супероксиддисмутаза 3)Гематопорфирин Первичный акцептор должен: 1)Поглощать свет в красной области спектра 2)Вступать в фотохимическую реакцию с липидами, вызывая их пероксидацию гематопорфирин Из них только гематопорфирин растворим в липидах и может запускать процесс цепного (перекисного) окисления липидов под действием света. Владимиров Ю. А. Московский Государственный Университет

При облучении фосфолипидных везикул в присутствии гемотопорфирина происходитперекисное окисление липидов Клебанов, Г.И., Теселкин, Ю.О., Бабенкова, И.В., Жамбалова, Б.А., Ванданмагсар, Б., Нестерова, O.A., Странадко, Е.Ф., Влияние липофильных антиоксидантов на фотосенсибилизированную производными гематопорфирина пероксидацию липосомальных мембран при облучении гелий-неоновым лазером. Биологические мембраны, (2): p Только гематопорфирин или только липосомы Гематопорфир ин + липосомы Доза облучения ГНЛ, Дж/ см 2 Владимиров Ю. А. Московский Государственный Университет

Фотодинамическая теория биостимулирующего действия света красного лазера Living cell 2 Chain lipid peroxidation 3 Ca 2+ influx into the cell Ca 2+ 1 LASER Photoionization Эндогенный сенсибилизатор (Порфирин) 4 Cell activation Priming of phagocytes Cell division activation Blast transformation of lymphocytes Владимиров, Ю.А. Три гипотезы о механизме действия лазерного облучения на клетки и организм человека, в сборнике «Эфферентная медицина», С.Я. Чикин (ред.). 1994, Институт Биомедицинской Химии РАМН: Москва. p Владимиров Ю. А. Московский Государственный Университет

The laser-induced leukocyte priming may be the first step in general response of the whole organism Klebanov, G.I., et al., Low-power laser irradiation induces leukocyte priming. Gen Physiol Biophys, (4): p The illumination by laser light induces priming in leukocytes that gives rise to increased production of ROS and NO by the cells. 2.EDRF, formed from NO, brings about vasodilatation effect and improves local and systemic blood circulation while 3.Moderate increase in SOD formation may stimulate cell metabolism and increase antibacterial capacity of phagocytes. 69с 1998 Владимиров Ю. А. Московский Государственный Университет

Изменение активности СОД в макрофагах после их облучения светом гелий-неонового лазера Доза, Дж/см нМ циклогексимид Макрофаги Клебанов, Г.И., Любицкий, О.В., Владимиров, Ю.А., Влияние низкоинтенсивного лазерного излучения красного диапазона на активность супероксиддисмутазы макрофагов. Биофизика, (3): p Владимиров Ю. А. Московский Государственный Университет

Приведет ли биостимуляция лейкоцитов к системному ответу организма? Machneva, T.V., N.V. Kosmacheva, Y.A. Vladimirov, A.N. Osipov, Effects of low power laser radiation of blue, green and red ranges on free radical processes in rat blood in endotoxic shock. Biochemistry (Moscow), (in press). Владимиров Ю. А. Московский Государственный Университет

Effect of laser illumination of rat ear on isolated leukocytes respiratory burst Normal ratsLPS treated rats Machneva, T.V., N.V. Kosmacheva, Y.A. Vladimirov, A.N. Osipov, Effects of low power laser radiation of blue, green and red ranges on free radical processes in rat blood in endotoxic shock. Biochemistry (Moscow), (in press). Владимиров Ю. А. Московский Государственный Университет

Доказательства того, что системные ответы на облучение светом лазера (или светодиода) в красной области объясняются фотодинамической теорией +210 nM protoporphyrin Two rats plasmas 634 nm Sensitive spectrofluorimeter FS-003V ( «Klaster» Limited, Russia) Fluorescence spectra of rat blood plasma Мачнева, Т.В., П.А. Ольховский, Д.М. Протопопов, Н.Н. Булгакова, Ю.А. Владимиров, А.Н. Осипов, Роль эндогенных порфиринов в лазерной терапии экспериментальных кожных ран. Биофизика, In press. Владимиров Ю. А. Московский Государственный Университет

There is an optimal concentration of porphyrins for in vivo laser action Normal Rats Владимиров Ю. А. Московский Государственный Университет

There is an optimal concentration of porphyrins for in vivo laser action SOD activity Initial level in the blood plasma (IL) 1 hour After irradiation (AR) AR/ IL LPS - treated Rats Владимиров Ю. А. Московский Государственный Университет

Not any effects occur without illumination (Control) The level 4 hours after first blood withdraw (AR) AR / IL Normal Rats Владимиров Ю. А. Московский Государственный Университет

Photodynamic hypothesis on the organism level Organism level 2008-now OO MPO SOD H2O2H2O2 RedOx signalling Cytokines LPO products SOD expression Priming Ca2+ NO Cellular level Gennady Klebanov 1994 Porphyrin Lipid Proxidation LPO products LaserLED Molecular level Владимиров Ю. А. Московский Государственный Университет

Данные о механизме действия синего и инфракрасного света Vladimirov, Y.A., [Three hypotheses on the mechanism of action of laser irradiation on the cells and human body], in Efferent Medicine, S. Chikin, Editor. 1994, Institute of Physical- Chemical Medicine. Moscow. p Vladimirov, Y.A., A.N. Osipov, G.I. Klebanov, Photobiological Principles of Therapeutic Applications of Laser Radiation. Biochemistry (Moscow), (1): p Мишенями для синего и зеленого света могут быть: 1.NO гемоглобин (переносчик кислорода) 2.NO цитохром c (переносчик электронов) 3.NO цитохром c в комплексе с кардиолипином (пероксидаза, нзапускающая апоптоз) В 1994 году нами была выдвинута гипотеза о том, что при действии лазерного излучения может происходить фотолиз гиминовых комплексов NO, что приводит к сосудорасширяющему эффекту и улучшению местного кровообращения Мишенью для ближнего ИК излучения может быть 1.NO цитохромоксидаза Владимиров Ю. А. Московский Государственный Университет

HbNO Photolysis under action of laser light 441 nm. (Low-temperature EPR) HbNO 0,45 mM. Irradiation power 170 W/m 2. Borisenko, G.G., Osipov, A.N., Kazarinov, K.D., and Vladimirov Yu, A. (1997) Biochemistry (Mosc) 62, Владимиров Ю. А. Московский Государственный Университет

Irradiation of HbNO Produces Free NO in hemolysate HbNO EPR hHbNO Hb + NO He-Cd laser (441 nm), 40 mW Mittermayr, R., Osipov, A., Piskernik, C., Haindl, S., Dungel, P., Weber, C., Vladimirov, Y.A., Redl, H., and Kozlov, A.V. (2007) Mol Med 13, Vladimirov, Y., Borisenko, G., Boriskina, N., Kazarinov, K., and Osipov, A. (2000) J Photochem Photobiol B 59, in erythrocytes NO electrode Владимиров Ю. А. Московский Государственный Университет

Effect of Laser Irradiation ( on Cyt c +2 NO Complex Effect of Laser Irradiation ( 441 nm) on Cyt c +2 NO Complex Cyt c + NO h Cyt c-NO Борисенко, Г.Г., С.С. Постнов, К.Д. Казаринов, А.Н. Осипов, Ю.А. Владимиров, Нитрознльные комплексы цитохромов митохондриальной цепи - первичные хромофоры в механизме фотоактивации дыхания. Биологические мембраны, (5): p Владимиров Ю. А. Московский Государственный Университет

Effect of Laser irradiation on the peroxidase activity of Cytochrome c/ TOCL A.N. Osipov, G.O. Stepanov 2006 A.N. Osipov, G.O. Stepanov, Y.A. Vladimirov, A.V. Kozlov, V.E. Kagan, Regulation of cytochrome C peroxidase activity by nitric oxide and laser irradiation. Biochemistry (Mosc), (10): p nm, 12 J /cm 2 Владимиров Ю. А. Московский Государственный Университет

Laser irradiation does not affect the systemic levels of cGMP and MAP Mittermayr, R., A. Osipov, et al. (2007). "Blue laser light increases perfusion of a skin flap via release of nitric oxide from hemoglobin." Mol Med 13(1-2): The RBC containing NO-Hb or Hb do not affect systemic MAP or cGMP level. And laser irradiation also does not affect these indices after erythrocyte infusion. Владимиров Ю. А. Московский Государственный Университет

Laser radiation increase significantly the rate of the local blood circulation in skin-flaps Quantification of laser Doppler scans of the epigastric skin-flap in the rat. + NO NO Infusion 2D laser-Doppler Basal circulation Enhanced circulation 2007 Neither infusion of NO-Hb alone, nor laser irradiation without NO-Hb infusion, did not influence local circulation. Only a combination of NO-Hb infusion and laser irradiation resulted in a remarkable increase of blood flow. We observed the main effect of epigastric artery irradiation directly distal to the laser focus. Mittermayr, R., A. Osipov, C. Piskernik, S. Haindl, P. Dungel, C. Weber, Y.A. Vladimirov, H. Redl, A.V. Kozlov, Blue laser light increases perfusion of a skin flap via release of nitric oxide from hemoglobin. Mol Med, (1-2): p Владимиров Ю. А. Московский Государственный Университет

Биостимулирующее действие лазерного света на митохондрии hνhν Выделение митохондрий Изучение дыхания митохондрий Схема опытов Владимиров Ю. А. Московский Государственный Университет

Действие света разных длин волн на скорость потребления кислорода митохондриями в состоянии окислительного фосфорилирования (состояние 3 по Б. Чансу) Контроль – Необлученные митохондрии Норма Эндотоксический шок Повреждение Стимуляция Повреждение Стимуляция Владимиров Ю. А. Московский Государственный Университет

Подавление скорости дыхания может быть вызвано NO, который связывается с цитохромоксидазой Brown, G., Nitric oxide and mitochondrial respiration. Biochim Biophys Acta, (2-3): p Complex I Complex III Complex II Цитохромоксидаза Цитохромоксидаза Complex IV ATP-synthase Inner membrane NADHNAD+ SuccFum O2O2 H2OH2O ATP Межмембранное пространство Матрикс Q Cyt c Q ADP NO electron Will mitochondria inhibited by low exogenous NO amounts be sensitive to irradiation? Владимиров Ю. А. Московский Государственный Университет

NO подавляет дыхание митохондрий. Но лазерное облучение его восстанавливает! Данные получены Т. В. Жидковой и А. Буравлёвым в нашей лаборатории в 2011 году Control – not irradiated sample of normal mitochondria Владимиров Ю. А. Московский Государственный Университет

Правда ли, что действие NO на дыхание было обусловлено блокированием цитохромоксидазы? Control – not irradiated sample of normal mitochondria * * * * Initial NO 442 nm + NO + NO + light 532 nm 650 nm Активность цитохромоксидазы Да! Владимиров Ю. А. Московский Государственный Университет

В спектре действия лазерного облучения на адгезию клеток на подложке есть максимумы в ближней ИК области (760 и 820 нм), приписываемые цитохромоксидазе dose 52 J/m 2, intensity 1.3 W/m 2 Cell attachment to glass depends on wavelength used for irradiation of samples of a suspension Karu, T.I., Pyatibrat, L.V., Ryabykh, T.P., Melatonin modulates the action of near infrared radiation on cell adhesion. J Pineal Res, (3): p В наших опытах стимулирующий эффект наблюдали при 5 Дж/см 2 Владимиров Ю. А. Московский Государственный Университет

Спектр действия фотолиза CO- цитохромоксидазы Photochemical action spectra of the relief of CO inhibition of the oxygen consumption of the reconstituted cytochrome and lactate oxidase systems. Владимиров Ю. А. Московский Государственный Университет

Общее заключение Все известные нам достоверные данные литературы и наши опыты с модельными системами, клетками и организмом животных по биостимулирующему (благоприятному) действию лазерного излучения могут быть объяснены протеканием одной из двух (или обеих) первичных фотохимических реакций: 1.Перекисным окислением липидов в результате фотосенсибилизированных эндогенными порфиринами фотохимических процессов. 2.Фотолизом комплексов гемопротеинов с NO. красное излучение ближнем ИК-диапазоне Вследствие экранирующего действия гемоглобина крови (длины волн короче 600 нм) эффективными при лазерной терапии оказывается в большинстве случаев красное излучение с длиной волны более 600 нм, которое может вызывать обе реакции, либо излучение в ближнем ИК-диапазоне ( нм), где может происходить фотолиз комплекса NO с цитохромоксидазой. Владимиров Ю. А. Московский Государственный Университет

Thank You ! Thanks to the staff of the Medical Biophysics Department, Moscow State University (left) and Biophysics Department, Russian State Medical University (right) for assistance and fruitful cooperation. Владимиров Ю. А. Московский Государственный Университет