Основы генетической инженерии растений

Определение генетической инженерии Генетическая инженерия (современная биотехнология)– это технология получение новых комбинаций генетического материала путем проводимых вне клетки манипуляций с молекулами нуклеиновых кислот и переноса созданных конструкций генов в живой организм, в результате которого достигается их включение и активность в этом организме и у его потомства Генетическая инженерия (современная биотехнология)– это технология получение новых комбинаций генетического материала путем проводимых вне клетки манипуляций с молекулами нуклеиновых кислот и переноса созданных конструкций генов в живой организм, в результате которого достигается их включение и активность в этом организме и у его потомства

"живой измененный организм" (генетически модифицированный, генетически измененный, трансгенный, генно-инженерный организм…) означает любой живой организм, обладающий новой комбинацией генетического материала, полученной благодаря использованию современной биотехнологии (Картахенский протокол по биобезопасности, ст.3)

Типичная трансгенная вставка

Выделение и идентификация отдельных генов (соответствующих фрагментов ДНК или РНК) Получение генетических конструкций путем манипуляций с нуклеиновыми кислотами in vitro Создание векторных систем для переноса трансгенов в клетки Перенос трансгенов в отдельные живые клетки, где они могут реплицироваться и передаваться дочерним клеткам Получение из трансформированных клеток ГМО Этапы создания ГМО

Технология рекомбинантных ДНК Выделение ДНК и «разрезание» ее на отдельные фрагменты с помощью рестриктаз Выделение ДНК и «разрезание» ее на отдельные фрагменты с помощью рестриктаз Клонирование генов Клонирование генов Разделение фрагментов ДНК в пространстве с помощью электрофореза или клонирования в клетках E.coli Разделение фрагментов ДНК в пространстве с помощью электрофореза или клонирования в клетках E.coli Идентификация и модификация отдельных фрагментов ДНК или искусственный синтез генов, регуляторных элементов Идентификация и модификация отдельных фрагментов ДНК или искусственный синтез генов, регуляторных элементов Соединение определенных фрагментов ДНК с целью построения генетических конструкций Соединение определенных фрагментов ДНК с целью построения генетических конструкций

Нуклеотидные последовательности, распознаваемые некоторыми ферментами рестрикции и характер получаемых концов ДНК РестриктазаСайт узнаванияХарактер получаемых концов ДНК EcoRIГА-А-Т-Т-Ц Ц-Т-Т-А-АГ «Липкие» концы с 5- фосфатной группой BamHIГГ-А-Т-Ц-Ц Ц-Ц-Т-А-ГГ «Липкие» концы с 5- фосфатной группой PstIЦ-Т-Г-Ц-АГ ГА-Ц-Г-Т-Ц «Липкие» концы с 3- фосфатной группой Sau3AI Г-А-Т-Ц Ц-Т-А-Г «Липкие» концы с 5- фосфатной группой NotIГЦ-Г-Г-Ц-Ц-Г-Ц Ц-Г-Ц-Ц-Г-Г-ЦГ «Липкие» концы с 5- фосфатной группой PvuIIЦ-А-ГЦ-Т-Г Г-Т-ЦГ-А-Ц «Тупые» концы HpaI Г-Т-ТА-А-Ц Ц-А-АТ-Т-Г «Тупые» концы HaeIII Г-ГЦ-Ц Ц-ЦГ-Г «Тупые» концы

Если объединить в одной пробирке фрагменты ДНК любого происхождения, полученные с помощью одной и той же рестриктазы, дающей "липкие концы", то эти фрагменты соединятся между собой. Для воссоединения фосфодиэфирных связей между концами сшиваемых фрагментов ДНК необходим фермент ДНК-лигаза. Если объединить в одной пробирке фрагменты ДНК любого происхождения, полученные с помощью одной и той же рестриктазы, дающей "липкие концы", то эти фрагменты соединятся между собой. Для воссоединения фосфодиэфирных связей между концами сшиваемых фрагментов ДНК необходим фермент ДНК-лигаза. Для целей генной инженерии большое значение имеет использование еще одного фермента – концевой трансферазы из тимуса теленка, который катализирует присоединение нуклеотидов к 3- концам цепей ДНК. Благодаря этому из «тупого» конца ДНК несложно сделать «липкий». Для целей генной инженерии большое значение имеет использование еще одного фермента – концевой трансферазы из тимуса теленка, который катализирует присоединение нуклеотидов к 3- концам цепей ДНК. Благодаря этому из «тупого» конца ДНК несложно сделать «липкий».

Линкеры

Годом рождения генетической инженерии является 1972 г., когда появились первые публикации сотрудников лаборатории П.Берга (США). В них сообщалось о получении кольцевой молекулы ДНК вируса SV40 путем последовательного ее разрезания рестриктазой RI и сшивания ДНК лигазой [Mertz, Davis, 1972], а также возможности с помощью этих ферментов встраивать в такую молекулу гены других организмов: фага-λ и галактозный оперон бактерии E.coli [Jackson, Symons, Berg, 1972]. Годом рождения генетической инженерии является 1972 г., когда появились первые публикации сотрудников лаборатории П.Берга (США). В них сообщалось о получении кольцевой молекулы ДНК вируса SV40 путем последовательного ее разрезания рестриктазой RI и сшивания ДНК лигазой [Mertz, Davis, 1972], а также возможности с помощью этих ферментов встраивать в такую молекулу гены других организмов: фага-λ и галактозный оперон бактерии E.coli [Jackson, Symons, Berg, 1972]. Первая функционально активная молекула рекомбинантной ДНК была получена в 1973 году. Г.Бойер и С.Коэн (США) сумели "пришить" к плазмиде E.сoli фрагмент ДНК плазмиды другой бактерии и обнаружили, что такая химерная плазмида могла успешно функционировать в клетках E.сoli, размножаться и передаваться другим клеткам как естественным путем, так и с помощью человека [Cohen et al., 1973] Первая функционально активная молекула рекомбинантной ДНК была получена в 1973 году. Г.Бойер и С.Коэн (США) сумели "пришить" к плазмиде E.сoli фрагмент ДНК плазмиды другой бактерии и обнаружили, что такая химерная плазмида могла успешно функционировать в клетках E.сoli, размножаться и передаваться другим клеткам как естественным путем, так и с помощью человека [Cohen et al., 1973]

Создание рекомбинантной плазмиды

Основные требования к вектору клонирования небольшой размер, поскольку эффективность клонирования чужеродной ДНК в E. сoli значительно снижается при общей длине привнесенной рекомбинантной плазмиды более 15 т.п.н.; небольшой размер, поскольку эффективность клонирования чужеродной ДНК в E. сoli значительно снижается при общей длине привнесенной рекомбинантной плазмиды более 15 т.п.н.; наличие уникального сайта рестрикции, в который может быть осуществлена вставка; наличие уникального сайта рестрикции, в который может быть осуществлена вставка; наличие одного или нескольких селективных генетических маркеров для идентификации трансформированных клеток (то есть включивших привнесенные гены). В качестве последних чаще всего используют гены устойчивости к антибиотикам или гербицидам. наличие одного или нескольких селективных генетических маркеров для идентификации трансформированных клеток (то есть включивших привнесенные гены). В качестве последних чаще всего используют гены устойчивости к антибиотикам или гербицидам.

Помимо бактериальных плазмид для целей клонирования генов используют и другие векторные системы: Помимо бактериальных плазмид для целей клонирования генов используют и другие векторные системы: фаги (в них можно клонировать более длинные, нежели в плазмидах, фрагменты донорной ДНК: до 20 т.п.н), фаги (в них можно клонировать более длинные, нежели в плазмидах, фрагменты донорной ДНК: до 20 т.п.н), плазмиды-космиды, содержащие cos-участок генома фага, участвующий в упаковке ДНК в фаговую головку (в них можно клонировать фрагменты ДНК до 40 т.п.н), плазмиды-космиды, содержащие cos-участок генома фага, участвующий в упаковке ДНК в фаговую головку (в них можно клонировать фрагменты ДНК до 40 т.п.н), Искусственные хромосомы: на основе фага Р1 ( можно клонировать фрагменты ДНК длиной т.п.н.), на основе фага Р1 ( можно клонировать фрагменты ДНК длиной т.п.н.), на основе F-плазмиды E. сoli (BAC – бактериальная искусственная хромосома, емкость т.п.н.), на основе F-плазмиды E. сoli (BAC – бактериальная искусственная хромосома, емкость т.п.н.), дрожжей (YAC-дрожжевая искусственная хромосома, в ней можно клонировать фрагменты эукариотической ДНК длиной порядка 800 т.п.н и более). дрожжей (YAC-дрожжевая искусственная хромосома, в ней можно клонировать фрагменты эукариотической ДНК длиной порядка 800 т.п.н и более). В качестве клеток-хозяев для клонирования генов помимо E. сoli используют также Bacillus subtilis, дрожжи Saccharomyces cerevisiae и др. В качестве клеток-хозяев для клонирования генов помимо E. сoli используют также Bacillus subtilis, дрожжи Saccharomyces cerevisiae и др.

Выделение генов Искусственный синтез генов На основании данных о последовательности аминокислот белка-продукта гена На основании данных о последовательности аминокислот белка-продукта гена С помощью ПЦР на основании данных о сиквенсе гена С помощью ПЦР на основании данных о сиквенсе гена С помощью RT-ПЦР на основе мРНК гена С помощью RT-ПЦР на основе мРНК гена Выделение генов из смеси рестрикционных фрагментов геномной ДНК - с помощью электрофореза и in situ гибридизации ДНК с мечеными зондами - путем создания и анализа клонотек генов

Получение к ДНК с РНК-матрицы с помощью фермента обратной транскриптазы

Блоттинг по Саузерну

Строение генетических конструкций

Целевые гены. Трансгены и цисгены. Смысловые и антисмысловые конструкции Основные признаки: толерантность к гербицидам, толерантность к гербицидам, устойчивость к насекомым-вредителям, устойчивость к насекомым-вредителям, устойчивость к вирусным болезням, устойчивость к вирусным болезням, система получения гетерозисных гибридов на основе мужской стерильности/восстановления фертильности, система получения гетерозисных гибридов на основе мужской стерильности/восстановления фертильности, устойчивость к засухе, устойчивость к засухе, пригодность для производства биотоплива. пригодность для производства биотоплива. удлинение сроков созревания и способность к длительному хранению, улучшенные качественные характеристики (состава жирных кислот растительного масла, крахмала, пониженное содержание никотина в листьях табака), улучшенные кормовые свойства, удлинение сроков созревания и способность к длительному хранению, улучшенные качественные характеристики (состава жирных кислот растительного масла, крахмала, пониженное содержание никотина в листьях табака), улучшенные кормовые свойства,

Селективные гены Гены устойчивости к антибиотикам: npt II (neo, aphII ) неомицинфосфотрансферазы II из транспозона Tn5 E. coli npt II (neo, aphII ) неомицинфосфотрансферазы II из транспозона Tn5 E. coli гены устойчивости к гигромицину В, стрептомицину, хлорамфениколу и др. гены устойчивости к гигромицину В, стрептомицину, хлорамфениколу и др. Гены толерантности к гербицидам: ген фосфинотрицин N-ацетилтрансферазы bar от Streptomyces hygroscopicus и ген pat от Streptomyces viridochromogenes ген фосфинотрицин N-ацетилтрансферазы bar от Streptomyces hygroscopicus и ген pat от Streptomyces viridochromogenes Гены ферментов, катаболизирующих нетоксичные сахара маннозу, D-ксилозу, 2-деоксиглюкозу (man, xylA) Гены ферментов, катаболизирующих нетоксичные сахара маннозу, D-ксилозу, 2-деоксиглюкозу (man, xylA) гены, обеспечивающие ростовые преимущества или повышенную способность к морфогенезу трансформированных клеток (ipt изопентил трансферазы из Ti-плазмиды A. tumefaciens) гены, обеспечивающие ростовые преимущества или повышенную способность к морфогенезу трансформированных клеток (ipt изопентил трансферазы из Ti-плазмиды A. tumefaciens)

Репортерные гены Ген gus (или uidA) фермента β-глюкоронидазы из E. coli Ген gus (или uidA) фермента β-глюкоронидазы из E. coli ген люциферазы (luc) из светлячков Photinus pyralis ген люциферазы (luc) из светлячков Photinus pyralis ген gfp зеленого флюоресцентного протеина (GFP- green fluorescent protein) из медузы Aequorea victoria. ген gfp зеленого флюоресцентного протеина (GFP- green fluorescent protein) из медузы Aequorea victoria.

Получение ГМО без селективных генов Использование генетических конструкций без целевых генов Использование генетических конструкций без целевых генов Целевой ген толерантности к гербицидам может быть использован и в качестве селективного Целевой ген толерантности к гербицидам может быть использован и в качестве селективного Котрансформация с последующим негативным отбором по селективным генам в расщепляющихся поколениях полученных трансформантов Котрансформация с последующим негативным отбором по селективным генам в расщепляющихся поколениях полученных трансформантов Удаления селективных генов из генома ГМО: использование генетических конструкций, содержащих последовательности транспозонов использование генетических конструкций, содержащих последовательности транспозонов использовании сайт-специфических рекомбиназ использовании сайт-специфических рекомбиназ

Промоторы, используемые в генетической инженерии растений 1. Конститутивные промоторы: CaMV35S – вируса мозаики цветной капусты CaMV35S – вируса мозаики цветной капусты CMoVb – вируса мозаики норичника CMoVb – вируса мозаики норичника гена nos нопалинсинтазы Agrobacterium tumefaciens гена nos нопалинсинтазы Agrobacterium tumefaciens гена ract1 актина риса гена ract1 актина риса гена ZmUbi убиквитина кукурузы гена ZmUbi убиквитина кукурузы 2. Тканеспецифические промоторы: PSsuAra от арабидопсиса (экспрессия в зеленых тканях) PSsuAra от арабидопсиса (экспрессия в зеленых тканях) PTA 29 от табака (экспрессия в пыльниках) PTA 29 от табака (экспрессия в пыльниках) rbcS от арабидопсиса (светочувствительный) rbcS от арабидопсиса (светочувствительный)

Методы переноса трансгенов в клетки растений Прямой (биолистика) Прямой (биолистика) Непрямой (агробактериальная трансформация) Непрямой (агробактериальная трансформация)

Приборы для биолистики

Агробактериальная трансформация с помощью Agrobacterium tumefaciens Gram - Gram - Dicots Dicots Worldwide Worldwide

Agrobacterium tumefaciens Опухоль возникает в результате необратимого переноса и включения определенного фрагмента (Т-ДНК, т.е. переносимой ДНК) плазмиды в хромосомную ДНК растительной клетки [Chilton et al., 1977]. Причем гены, расположенные на Т- фрагменте ДНК бактериальной плазмиды, активно экспрессируются в растительной клетке, что выражается в синтезе большого количества специфических соединений опинов октопинов и нопалинов. Помимо этих соединений в клетках образуются в повышенных концентрациях различные фитогормоны, резко стимулирующие ростовые процессы, что приводит к образованию опухоли. Опухоль возникает в результате необратимого переноса и включения определенного фрагмента (Т-ДНК, т.е. переносимой ДНК) плазмиды в хромосомную ДНК растительной клетки [Chilton et al., 1977]. Причем гены, расположенные на Т- фрагменте ДНК бактериальной плазмиды, активно экспрессируются в растительной клетке, что выражается в синтезе большого количества специфических соединений опинов октопинов и нопалинов. Помимо этих соединений в клетках образуются в повышенных концентрациях различные фитогормоны, резко стимулирующие ростовые процессы, что приводит к образованию опухоли.

Строение T-области Ti-плазмиды Agrobacterium tumefaciens

Агробактериальная трансформация

Коинтегративный и бинарный вектора Binary vector LBRB Co-integrative

Пример плазмидного бинарного вектора

Только трансформированные клетки способны делиться и регенерировать растения на питательной среде, содержащей селективный агент

Молекулярно-генетический анализ трансгенных растений Подтверждение вставки рекомбинантной ДНК: Саузерн-блоттинг Саузерн-блоттинг ПЦР-детекция целевого гена или других элементов вставки ПЦР-детекция целевого гена или других элементов вставки Определение количества копий вставки, анализ наследования целевого гена при половом размножении Определение количества копий вставки, анализ наследования целевого гена при половом размножении Подтверждение экспрессии целевого гена: Нозерн-блоттинг Нозерн-блоттинг ПЦР-детекция кДНК целевого гена ПЦР-детекция кДНК целевого гена Вестерн-блоттинг Вестерн-блоттинг Сиквенс кДНК целевого гена Сиквенс кДНК целевого гена Количественное определение степени экспрессии целевого гена Количественное определение степени экспрессии целевого гена

Методы детекции ГМС Основанные на выявлении белков-продуктов трансгенов (ELISA-тест) Основанные на выявлении белков-продуктов трансгенов (ELISA-тест) Основанные на детекции фрагментов ДНК, характерных для трансгенных вставок: Основанные на детекции фрагментов ДНК, характерных для трансгенных вставок: - ПЦР + элетрофорез - ПЦР в реальном времени - ПЦР+детекция ДНК на биочипе

Схема лабораторного исследования: Схема лабораторного исследования: Выделение ДНК Выделение ДНК Идентификация растительной ДНК Идентификация растительной ДНК Идентификация регуляторных последовательностей, маркерных генов Идентификация регуляторных последовательностей, маркерных генов Идентификация трансформационного события Идентификация трансформационного события Количественный анализ рекомбинантной ДНК Количественный анализ рекомбинантной ДНК

Специфичность ПЦР-анализа

Официально допущено к использованию 54 трансгенных событий (линий) кукурузы, в том числе 25 половых гибридов между различными ГМ-линиями. Из них 48 (89%) содержат 35S- промотор. Не содержат 35S-промотор линии GA21, MIR604, LY038, 3272, Event и гибрид MIR604×GA21. Линии GA21, MIR604 и 3272 содержат терминатор NOS. Официально допущено к использованию 54 трансгенных событий (линий) кукурузы, в том числе 25 половых гибридов между различными ГМ-линиями. Из них 48 (89%) содержат 35S- промотор. Не содержат 35S-промотор линии GA21, MIR604, LY038, 3272, Event и гибрид MIR604×GA21. Линии GA21, MIR604 и 3272 содержат терминатор NOS. Официально допущено к использованию 17 трансгенных событий (линий) сои. Из них 11 содержат 35S-промотор. Официально допущено к использованию 17 трансгенных событий (линий) сои. Из них 11 содержат 35S-промотор.

Чувствительность метода ПЦР+электрофорез составляет 0,1%ГМО (35Sпромотор), что подтверждается анализом соответствующих референсных материалов: ОK 413b 411b 413a 410b 410a ПК Соя ПК Кук ОK 413b 411b 413a 410b 410a ПК Соя ПК Кук

Экспрессия трансгенов Транзиентная Транзиентная Стабильная Стабильная Факторы, оказывающие влияние на стабильную экспрессию: Факторы, оказывающие влияние на стабильную экспрессию: Защитная реакция растений на чужеродный генетический материал Защитная реакция растений на чужеродный генетический материал Размер вставки и количество копий Размер вставки и количество копий Перестройки ДНК вставки Перестройки ДНК вставки Состав вставки Состав вставки Строение трансгенов Строение трансгенов Строение промоторов Строение промоторов Место встраивания в геном Место встраивания в геном