Генетические задачи решаются легко только тогда, когда они предварительно уже решены другими. Поэтому необходимо предостеречь тех, кто впервые приступает к генетическому анализу, от уныния и пессимизма, если их первые попытки окажутся неудачными. Александр Сергеевич Серебровский

1.ПЦР – общие понятия и принципы работы. 2.ПЦР в реальном времени.

Основные принципы ПЦР В 1983 году Мюллисом была разработана технология полимеразной цепной реакции (ПЦР), которая получила очень большое распространение. В настоящее время ПЦРпризнана как наиболее производительная и относительно простая технология амплификации (многократного копирования) небольших количеств образцов ДНК, которая способна увеличить количество копий исходной пробы в миллионы раз в течение нескольких часов (Newton, Graham, 1997). Kary Baron Mullis Существующие методы полимеразной цепной реакции можно классифицировать по типам используемых праймеров. В ходе ПЦР могут быть использованы неспецифические (произвольные) праймеры (искусственно синтезированные нуклеотидные последовательности), которые комплементарно соответствуют тем последовательностям нуклеотидов, которые обычно с большей или меньшей частотой встречаются в геномах разных видов (random primed amplification произвольно праймированная амплификация); и специфические праймеры, сконструированные (синтезированные) на основе тех нуклеотидных последовательностей, которые примыкают к изучаемому региону ДНК - группа STS-маркеров (Sequence-Tagged Sites).

Основные принципы ПЦР. Random PCR В 1990 году, независимо друг от друга, две исследовательские группы предложили для выявления полиморфизма ДНК использовать полимеразную цепную реакцию с одним коротким олигонуклеотидным праймером произвольной структуры. После электрофоретического разделения и визуализации продуктов ПЦР фрагменты амплифицированной ДНК различной молекулярной массы использовали как молекулярные маркеры для анализа генома. Одна группа (Williams et al., 1990) назвала такие молекулярные маркеры RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA), другая (Welsh, McClelland, 1990) - AP-PCR (Arbitrary Primer PCR). Несколько позже были предложены и другие похожие методы (Caetano-Anolles et al., 1991) - DAF (DNA Amplification Fingerprinting) (Булат и др., 1992) - УП-ПЦР (ПЦР с универсальными праймерами). Все они основывались па использовании одного праймера произвольной структуры и отличались только, в основном, длиной синтезированных праймеров. Достоинства метода: В случае применения "произвольных" праймеров нет необходимости в предварительном клонировании и секвенировании соответствующих фрагментов генома, в использовании гибридизации, авторадиографии или других достаточно трудоемких методов визуализации продуктов анализа.

Основные принципы Random PCR анализа (гаплоидные ткани)

Произвольная амплификация является недетерминированным процессом, не требующим предварительного знания матричной последовательности и использующим единичные или множественные сайты в геноме. Этот тип амплификации может использовать один или несколько произвольных праймеров или комбинацию произволь- ного и направленного праймеров к специфическим, но неизвестным сайтам в геноме, многие из которых являются полиморфными. rPCR (Random Polymerase Chain Reaction – произвольная ПЦР). Этот метод позволяет конструировать библиотеки полных кДНК из очень малого количества РНК (эквивалентного количеству РНК, содержащейся в одной эукариотической клетке, ста клетках бактерий или в ста тысячах частиц ретровируса). В качестве праймера для синтеза кДНК используют универсальный праймер, содержащий на 3'-конце гексамер с призвольной последовательностью (Froussard, 1993). RAPD анализ (Random Amplified Polymorphic DNA произвольно амплифицированная полиморфная ДНК). Оригинальность RAPD-анализа заключается в двух особенностях: при амплификации ДНК применяется только один праймер, так как мишенью являются, как принято считать, инвертированные повторы в геноме; для использования произвольных праймеров нет необходимости в предварительном клонировании и секвенировании соответствующих фрагментов генома. При подборе праймеров для RAPD-анализа достаточно выполнения следующих условий: олигонуклеотидная последовательность праймера должна содержать oт 50 до 80% G+C оснований, а его длина должна быть около 10 оснований. Основные принципы ПЦР. Random PCR

RAPD-анализ характеризуется следующими свойствами: при использовании большинства типов праймеров RAPD-спектр представлен 5-12 амплимерными зонами; RAPD-маркеры обладают доминантным характером проявления; RAPD не включает в себя гибридизацию/авторадиографию или другие трудоемкие методы визуализации продуктов анализа; RAPD чувствителен к изменениям ПЦР-условий, поэтому воспроизведение результатов может быть получено лишь при максимальной стандартизации условий. AP-PCR (Arbitrarily Primed Polymerase Chain Reaction произвольно праймированная ПЦР). В данном типе ПЦР используются праймеры, сходные по длине с таковыми в классической ПЦР ( нуклеотидов). Особенностью этого метода является проведение отжига праймера в нескольких первых циклах при более низкой, чем оптимальная, температуре (так называемый "мягкий" отжиг), что повышает эффективность праймирования при дальнейших "жестких" циклах. Продукты амплификации разделяют в агарозном геле и визуализируют бромистым этидием. DAF (DNA Amplification Fingerprinting фингерпринтинг ампл-ной ДНК). При DAF используют праймеры длиной 5-8 нуклеотидов. Сложные информационно насыщенные профили ДНК получают в полиакриламидном геле и окрашивают серебром для обнаружения пикограммовых количеств ДНК. В результате DAF с октамерным праймером образуются фингерпринтеры в 3-10 раз более сложные, чем ДНК-профили, полученные при RAPD-анализе с декамерным праймером. Техника DAF использовалась для характеристики многих организмов - от бактерий до человека. Основные принципы ПЦР. Random PCR

Наибольшую популярность среди данного типа методов получил RAPD. Он использовался для всестороннего исследования генома организмов: конструирование генетических карт; анализ генетической структуры популяций; генотипирование; маркирование признаков и др. В то же время, этот и подобные ему методы были не лишены некоторых недостатков: 1)"произвольные" (случайные) маркеры, обладая доминантным характером проявления, не могли быть использованы при типировке гомозиготных и гетерозиготных амплифицированных образцов; 2)при интерпретации амплимеров, исходя из различной разрешающей способности применяемых гелей, необходимо было также учитывать и явление комиграции; 3)существовавшие проблемы воспроизводимости: результаты оказались очень чувствительны к изменениям ПЦР-условий, поэтому достоверные результаты можно было получить лишь при максимальной стандартизации условий. Основные принципы ПЦР. Random PCR

Random PCR (RAPD, DAF, AP-PCR), AFLP – интерпретация результатов RAPD, DAF, AP-PCR, AFLP. Анализ полученных результатов проводят визуально (RAPD, AP-PCR), либо с помощью специального программного обеспечения вследствие сложности электрофоретического спектра (DAF, AFLP). Данная группа маркеров характеризуется доминантным типом проявления и диаллельной системой: "1" - наличие ампликона (доминантный аллель) и "О" - отсутствие ампликона (рецессивный аллель), в той или иной зоне гелевой пластины. Исходя из доминантного характера проявления маркеров данной группы, различать гомозиготные (по доминантному аллелю) и гетерозиготные генотипы образцов, при использовании диплоидных или полиплоидных тканей, не представляется возможным. При характеристике организма описывается спектр (фенотип) ПЦР продуктов (таблица). Обозначение зон производится по названию праймера, отобранного для полимеразной цепной реакции, и размера зоны (в парах нуклеотидов) в надстрочнике. Так, например, зона размером в 670 п.н. в электрофоретическом спектре продуктов ПЦР с праймером Oligo 12 обозначается - Oligo RAPD-спектр корневой губки при использовании праймера Oligo 12 (диплоидные ткани, доминантный характер проявления аллелей) Название зоны Номера образцов Oligo Oligo Oligo Oligo

Random PCR (RAPD, DAF, AP-PCR), AFLP; CAP – интепретация результатов Важным моментом при проведении RAPD-анализа является необходимость использования только специфических зон для данного вида, поскольку включение минорных, артефактных зон может привести к искажению результатов анализа. Наличие артефактных зон может быть связано с загрязнением изучаемых препаратов чужеродной ДНК. Появление минорных фракций может быть вызвано, как наличием внешнего загрязнения, так и неправильно подобранными условиями отжига. Устранение минорных зон может быть достигнуто увеличением температуры отжига, снижением концентрации хлорида магния в реакционной смеси и т. д. Артефактные зоны из анализа исключаются и в дальнейшем не учитываются. При использовании новых RAPD-праймеров необходимо провести предварительное исследование воспроизводимости выявляемых спектров. По окончании сравнительного анализа следует оставлять только наиболее четкие зоны, обладающие полной воспроизводимостью. RFLP, САР. Интерпретацию полученных спектров проводят исходя из количества и величины (в парах нуклеотидов) выявленных зон. RFLP-спектр образцов дуба черешчатого при использовании комбинации рестриктазы Hindlll и пробы Rbkl 12 (диплоидные ткани, кодоминантный характер проявления аллелей) Аллели: А 1 зона: 2220 п.н. (отсутствие рестрикции), В 2 зоны: 2120 п.н. и 100 п.н., С 2 зоны: 1660 п.н. и 560 п.н. Генотипы образцов Rbkl 12(HindIII): 1 АВ, 2-5,7 АА, 6 АС, 8 СС

Таким образом, исходя из неспецифичности и доминантного характера наследования RAPD-локусов и сходных маркеров, использование данной технологии в популяционно-генетических и таксономических исследованиях, как оказалось, имело ряд ограничений. При проведении селекционных работ, наоборот, RAPD-анализ являлся достаточно эффективным методом, особенно для типировки генотипов, особей, клонов, форм и т.д. Это связано с большим количеством маркеров, выявляемых с помощью данного метода. При использовании даже одного какого-либо праймера, RAPD-спектр обычно представлен в виде пяти и более ампликонов, т.е. маркерных фрагментов. Таким образом, применяя различные праймеры, можно выявить и в дальнейшем использовать сотни генетических маркеров. Это позволяет сравнивать большое количество фрагментов ДНК, разбросанных по всему геному. Однако при определенных условиях эти достоинства становились недостатками данного метода. В ряде случаев некоторые амплифицированные фрагменты встречались у многих особей одного или разных видов, что затрудняло их диагностирование. Для преодоления этой проблемы необходимо было синтезировать специфические праймеры для амплификации только конкретного гена или определенного фрагмента ДНК. Основные принципы ПЦР. Random PCR

Основные принципы ПЦР. STS PCR Технологии, которые позволяют проводить ПЦР-анализ отдельных детерминант объединены под общим названием STS (Sequence-Tagged Sites). В эту группу вошли такие методы как SCAR, EST, ISSR, CAPS, STMS и др., отличающиеся по своим подходам к выявлению видоспецифических фрагментов. В случае метода SCAR (Sequence-Characterised Amplified Regions), первоначально с помощью ПЦР-анализа с произвольными праймерами устанавливают фрагменты, которые могут маркировать отдельные формы или виды, затем ампликоны вырезают из геля, секвенируют для установления нуклеотидной последовательности и синтезируют специфические праймеры, комплементарные началу и концу данного участка ДНК (Antolin, 1996). При использовании метода EST (Expressed Sequence Tag) сна- чала выделяют из клетки специфичную для данного организма матричную РНК, затем, с помощью фермента обратной транскриптазы, синтезируют кДНК, комплементарную этой мРНК, секвенируют ее и синтезируют праймеры для начала и конца гена, или его фрагмента (Karp et al., 1997). Одним из наиболее популярных методов, используемых для идентификации организмов одного вида, явился SSR-метод (Simple Sequence Repeats), или STMS-метод (Sequence-Tagget Microsatellites), в основе которого лежит анализ микросателлитов.

Основные принципы ПЦР. STS PCR Амплификация со специфическими праймерами является де- терминированным процессом, требующим знания последовательности матрицы, а мишенью являются один определенный либо многочисленные сайты амплификации на обеих нитях ДНК. В зависимости от целей и задач исследований можно выделить несколько типов ПЦР со специфическими праймерами: VNTR (Variable Number of Tandem Repeats - варьирующее число тандемных повторов). Значительная часть повторяющейся (сателлитной) ДНК состоит из тандемно повторяющихся копий длиной 1-6 нуклеотидов (микросателлиты, или SSR - Simple Sequence Repeat) и от 9-10 до несколько сотен нуклеотидов каждая (минисателлиты). Минисателлитный локус может насчитывать до нескольких сотен повторов, микросателлитный локус - до ста повторов. Мутации типа инсерция/делеция, изменяют число повторов, т. е. общую длину такой многокопийной последовательности. Таким образом, аллели данных локусов отличаются друг от друга числом тандемно повторяющихся копий. Большинство микросателлитных локусов полиморфны и имеют 5 и более вариантов. Применение этого метода в "ДНК-дактилоскопии" играет существенную роль. Так, например,использование только 5 микросателлитных локусов позволяет типировать особи в популяции с частотой ошибки менее 0,01%.

Основные принципы ПЦР. VNTR анализ Полиморфизм - существование более чем одного варианта последовательности ДНК (гена, маркера) с частотой, превышающей частоту обратного мутирования. (на практике >1%)

Основные принципы ПЦР. VNTR анализ Схема выявления изменчивости для VNTR-локусов Микро- и минисателлитные маркеры характеризуются кодоминантным типом проявления (за исключением "нулевых" аллелей). Таким образом, гомозиготные образцы представлены на фореграммах одной фракцией, а гетерозиготные двумя (диплоидные ткани) и более (полиплоидные ткани) электрофоретическими вариантами.

Основные принципы ПЦР. STS PCR SCAR (Sequence-Characterised Amplified Regions - амплифицируемые регионы с известной нуклеотидной последовательностью). Данные маркеры представлены ДНК-локусами, для которых определена нуклеотидная последовательность). Если данная область является структурным геном или его фрагментом, то данный маркер обозначается как EST-маркер (Expressed Sequence Tag - экспрессируемые нуклеотидные последовательности). Дополнительный рестрикционный анализ SCAR- маркеров получил название CAPS-анализ (Cleaved Amplified Polymorphic Sequence - полиморфизм рестрикции амплифицированных нуклео- тидных последовательностей), или PCR-RFLP. Общий принцип выявления изменчивости SCAR-локусов (гаплоидные ткани)

Детекция полиморфизма по одиночным нуклеотидам (SNP) Общий принцип выявления полиморфизма SCAR-локусов (диплоидные ткани)

Основные принципы ПЦР. STS PCR Ассиметричная ПЦР. Используется для получения продуктов амплификации в одноцепочечной форме. Его суть заключается в том, что один из двух праймеров для ПЦР берется в 100-кратном избытке. На ранних циклах реакции происходит образование двухцепочечной ДНК и экспоненциальный рост ее количества. Как только пул лимитирующего праймера исчерпывается (примерно к 20-му циклу), начинается образование одноцепочечной ДНК. Ее накопление носит линейный характер, но этого оказывается достаточно для получения одноцепочечной ДНК в количествах, необходимых для секвенирования или использования в качестве зонда. Инвертированная ПЦР. Используется при изучении промоторных областей генов известных белков, сайтов интеграции провирусов, мобильных элементов. ДНК гидролизуется рестриктазой, вносящей разрывы не внутри известной последовательности, а в некоторых точках правее и левее ее. Образующийся фрагмент ДНК замыкается в кольцо с помощью ДНК-лигазы и амплифицируется в результате ПЦР. Основное отличие от стандартной ПЦР заключается в том, что праймеры, гибридизующиеся с концевыми участками известной последовательности, направлены З'-концами не внутрь ее, а наружу. В результате амплифицируются фланкирующие участки ДНК.

Основные принципы ПЦР. STS PCR Заякоренная ПЦР. Используется в случаях, когда для участка нуклеиновой кислоты, подлежащего амплификации, известна нуклеотидная последовательность лишь для одного праймера (напри- мер, в случае молекул РНК, для которых легко определить лишь 3'- концевую последовательность). Метод состоит в том, что с молекулы РНК получают кДНК-копию, к З'-концу которой пристраивают поли(dG)-блок с помощью терминальной трансферазы. Амплификацию такой кДНК проводят при участии "заякоренного" праймера, содержащего на 3'-конце поли(dC)-последовательпость и потому гибридизующегося с поли(dG-блоком, и "специфического'" праймера, синтезированного на основании известной 3'- концевой последовательности РНК. Также имеются и другие STS-технологии, позволяющие диагностировать различные организмы. Анализ по ним проводится на основании положительного или отрицательного результатов ПЦР-тестов. Аллель специфичная ПЦР.

ПЦР в реальном времени. Основные протоколы. Методы ПЦР в реальном времени можно разделить на две основные группы, различающиеся по способам генерации портерной флюоресценции: 1) применение интеркалирующих флюоресцентных агентов, флюоресценция которых значительно возрастает при связывании с двухцепочечной ДНК (интеркалирующим красителем наиболее часто является SYBR Green); 2)использование меченных флюоресцентными агентами олигонуклеотидных проб, комплементарных участку PCR-продукта (протоколы TaqMan, Molecular Beacons и LightCycler).

ПЦР в реальном времени. SYBR Green протокол SYBR Green SYBR Green анализ базируется на детекции и количественом определении флюоресцирующих комплексов ДНК-SYBR Green (Morrison et al., 1998). Особенность красителя SYBR Green заключается в способности образовывать комплексы только с двухцепочечной молекулой ДНК, которая в ПЦР присутствуют только на стадии отжига (праймер-матрица ДНК) и элонгации (ампликон). Таким образом, изменение флюоресцентной эмиссии на конечном этапе элонгации каждого последующего цикла, в основном, отражает увеличение числа ампликонов в ходе ПЦР. Достоинства: технология SYBR Green наиболее дешевая и простая в исполнении, позволяющая вносить элементы оптимизации в протекание реакции амплификации. Недостатки: -применение SYBR Green накладывает очень высокие требования к специфичности реакции. Это необходимо иметь в виду при выборе праймеров; - отсутствие контроля специфичности образовавшегося продукта; - при использовании данной технологии можно работать только с одной реакцией в одной реакционной смеси (в отличие, например, от TaqMan, где использование проб в одной реакционной смеси потенциально ограничивается возможностями конкретного амплификатора) и, при небольших количествах исходного образца ДНК, значительно уменьшается точность проводимого исследования.

ПЦР в реальном времени. TaqMan протокол TaqMan ПЦР TaqMan ПЦР основан на использовании 5'-экзонуклеазной активности полимеразы (Held et al., 1996). В реакционную смесь добавляют 2 праймера, комплементарных областям, фланкирующих амплифицируемый локус, и ДНК-зонд (проба), меченный на 5'-конце флюоресцентным красителем (Ф), а на 3'-конце тушителем флюоресценции (Т). Зонд комплементарен участку, находящемуся внутри ампликона. Тушитель поглощает испускаемое флюоресцентной меткой излучение. При отжиге зонд связывается с комплементарным участком ДНК внутри ампликона. Во время стадии элонгации полимераза синтезирует комплементарную цепь ДНК и, дойдя до участка, гибридизованного с зондом, начинает расщеп- лять его за счет 5'-экзонуклеазной активности. В результате флюоресцентная метка отделяется от тушителя, и ее свечение может быть детектировано. Таким образом, увеличение флюоресценции прямо пропорционально накоплению числа ампликонов.

ПЦР в реальном времени. TaqMan протокол Основным недостатком технологий, основанных на применении меченных флюоресцентными агентами олигонуклеотидных зондов, и частности, TaqMan, является достаточно высокая их стоимость по сравнению с SYBR Green. Следует иметь в виду, что при использовании технологии TaqMan имеется меньше возможностей для оптимизации реакции в отличие от применения интеркалирующих флюоресцентных агентов, при неудачно подобранных комбинациях зондов и праймеров придется подбирать новые, что еще больше увеличивает стоимость исследований. При использовании в качестве образца молекулы РНК, а не ДНК, в реакционную смесь добавляются реагенты для проведения обратной транскрипции и в программе ПЦР на первом этапе выпол- няется синтез кДНК, которая будет выступать в качестве исходной матрицы для последующей амплификации.

ПЦР в реальном времени. Molecular Beacon & Ligft Cicler Molecular Beacons Molecular Beacons отличается от TaqMan тем, что концы зонда (на которых находятся, соответственно, метка и тушитель флюоресценции) комплементарны друг другу (Mhlanga, Malmberg, 2001). В результате, при температуре отжига праймеров они схлопываются и образуют структуру типа "ручки сковородки" (stem-loop), где зона комплементарности зонда к изучаемому локусу находится в петле. При гибридизации зонда с матрицей вторичная структура разрушается, флюоресцентная метка и тушитель расходятся в разные стороны и флюоресценция от метки может быть детектирована. LightCycler технология LightCycler технология основана на использовании двух зондов, меченных флюоресцентной меткой (Wittwer et al., 1997). Принцип метода заключается в переносе энергии от одного флюорофора, находящегося на 3'-конце первого зонда (Д), ко второму флюорофору, находящемуся на 5'-конце второго зонда (А), который происходит в том случае, когда расстояние между флюорофорами составляет 1-3 нуклеотида. Все описанные технологии различаются как по сложности постановки, так и по цене. Использование двух меченых зондов в ходе анализа делает данный метод одним из наиболее затратных.

ПЦР в реальном времени. Интерпретация результатов Real-Time qPCR. Данный метод анализа позволяет получать как количественные данные о концентрации исходного локуса в образце (например, при изучении концентрации определенных видов микроорганизмов в тканях тела или воде), так и качественные данные по генотипической структуре (генотипирование). При использовании SYBR Green протокола, генотипирование основано на индивидуальных значениях температур плавления различных ампликонов, что связано с варьированием размера и нуклеотидного состава изучаемых фрагментов ДНК. Для оценки температуры плавления ампликонов в конце программы амплификации проводят анализ кривой плавления получившихся ПЦР-продуктов. В большинстве случаев, поставляемое программное обеспечение, используя анализ производной функции интенсивности флюоресценции в зависимости от температуры (-dl/dT), представляет данные в виде пиков, отражающих температуры плавления ампликонов. В случае наличия одного пика образец характе- ризуется наличием двух одинаковых аллелей, т. е. определяется как гомозигота. Если присутствует два различных пика образец определяется как гетерозигота.

ПЦР в реальном времени. Интерпретация результатов При использовании анализа кривых плавления для генотипирования, важными моментами являются: отсутствие неспецифических ампликонов в ПЦР-спектре, которые могут давать ложные пики, а также наличие достоверных различий температур плавления аллельных вариантов. При выполнении данных требований, количество выявляемых аллелей может составлять 5-7 вариантов. Установление генотипа на основании использования TaqMan протокола, требует использования количества зондов, равного числу искомых аллельных вариантов. При одновременном использовании нескольких зондов в ПЦР-смеси, они должны отличаться спектрами испускания света для одновременной детекции на разных каналах (разных длинах волн) фотодатчика RealTime-термоциклера. Кривые плавления гетерозиготного (слева) и гомозиготного (справа) по локусу QZag12 образцов дуба скального (диплоидные ткани) и их электрофоретические профили.

ПЦР в реальном времени. Интерпретация результатов Интерпретация получаемых результатов заключается в следующем: у гомозиготных организмов в ходе ПЦР будет происходить расщепление зонда только одного типа, и, соответственно, увеличение интенсивности свечения только в одном определенном волновом спектре. У гетерозиготных организмов в ходе реакции будет происходить расщепление зондов двух типов (в случае диплоидных тканей) и, соответственно, нарастание сигнала для двух различных длин волн в спектре испускания. Графики изменения интенсивности сигнала для гомозиготных и гетерозиготных образцов при детекции двух различных длин волн в ходе TaqMan протокола. Генотипы образцов: 1 АА, 2 АВ, 3 ВВ.

ПЦР в реальном времени. Интерпретация результатов