Подходы к повышению генетической компетенции M.gallisepticum

Цель Определить влияет ли тетрациклин на уровень генетической компетенции Mycoplasma gallisepticum

Задачи Обзор литературы Поиск белков – участников системы компетенции у M.gallisepticum Подобрать концентрацию тетрациклина и время шока при которых наблюдается максимальный уровень экспрессии генов участников компетенции Провести трансформацию плазмиды в М.gallisepticum в условиях стресса Провести трансформацию М. gallisepticum геномной ДНК устойчивого к ципрофлоксацину штамма

Почему это важно Микоплазмы низко компетентные организмы У микоплазм нет трансдукции У некоторых видов наблюдали конъюгацию Трансформация – один из основных методов генетической манипуляции микоплазмам Низкая частота трансформации обязывает использовать микрограмовые концентрации ДНК Для трансформации микоплазм используют обработку полиэтиленгликолем (PEG), электропорацию и липосомную доставку капсулированной ДНК. Последний метод оказался неэффективен для MGA.

В предыдущих сериях Первая трансформация микоплазм транспозоном Dybvig, K. and Cassell, G. H. (1987) Transposition of gram-positive transposon Tn916 in Acholeplasma laidlawii and Mycoplasma pulmonis. Science 235, 1392–1394. Трансформация Mycoplasma gallisepticum путем конъюгации Transposon mutagenesis of Mycoplasma gallisepticum by conjugation with enterococcus faecalis and determination of insertion site by direct genomic sequencing. Ruffin DC, van Santen VL, Zhang Y, Voelker LL, Panangala VS Dybvig K. (2000) Трансформация MGA S6 транспозоном при помощи PEG (создали библиотеку из 424 мутантов) Transposon mutagenesis of Mycoplasma gallisepticum Patricia L. Whetzel,1 Linda L. Hnatow,2 Calvin L. Keeler Jr.,* and John E. Dohms (2002) Биоинформатически показана высокая степень горизонтального переноса генов между M.gallisepticum и M. syniviae. Самый яркий случай в сравнении с другими микоплазмами. Christine Citti et al. Being Pathogenic, Plastic, and Sexual while Living with a Nearly Minimal Bacterial Genome, PLoS Genetics (2007)

Опыт трансформации плазмиды с геном устойчивости к тетрациклину и инактивации гена Vlh Lee, S.-W., Browning, G. F. & Markham, P. F. Development of a replicable oriC plasmid for Mycoplasma gallisepticum and Mycoplasma imitans, and gene disruption through homologous recombination in M. gallisepticum. Microbiology (Reading, England) 154, 2571–80 (2008). Вставляли участки oriC разной длины в tetM/pGEM-T (плазмида в которой уже находился ген устойчивости к тетрациклину) [pGTLori, pGTSori] Электропарация с 10 мкг плазмидной ДНК Частота трансформации 6*10 -7 Минимальный необходимый кусок oriC составил 180bp и включал два DnaA box участка и два AT богатых участка. На протяжении 5 пассажей pGTLori оставалась вне хромосомы, на 10 пассаже можно было наблюдать ее встройку в хромосомную ДНК Направленно выключить ген путем гомологичной рекомбинации не удалось. Плазмина встраивается преимущественно в область oriC. D одном случае прошла инактивация vlhA1.1 вместо vlhA3.03 (98% гомологии)

Компетенция у B.subtilis и S. pneumoniae B. subtilis ComX (55 аминокислот) ComX (10 аминокислот) Сom Q S.pneumoniae ComC (44 аминокислоты) CSP(17аминокислот) ComA ComB Гистидинкиназа

X-State – глобальный ответ Identification of competence pheromone responsive genes in Streptococcus pneumoniae by use of DNA microarrays

Гены M. gallisepticum предположительно играющие роль в компетенции MGA_0033 – аннатирован как участник компетенции согласно PFAM. Гомологичен comEC B.subtilis. Обычно трансмембранный белок, отвечающий за транспорт ДНК. MGA_0022 – ABC-транспортер. Гомологичен comA S.pneumoniae. Peptidase C39 ABC-Transporter Peptidase C39 ABC-Transporter ABC-membrane

Влияние антибиотиков на компетенцию Фторхинолоны индуцируют экспрессию генов компетенции и рекомбинации Некоторые ингибиторы трансляции (канамицин) приводили к схожему результату. При том что тетрациклин не показал такого эффекта. Marc Prudhomme et al. Antibiotic Stress Induces Genetic Transformability in the Human Pathogen Streptococcus pneumoniae, Science 313, 89 (2006) Xavier Charpentier et al. Antibiotics and UV Radiation Induce Competence for Natural Transformation in Legionella pneumophila, JOURNAL OF BACTERIOLOGY, Mar. 2011

Уровень экспрессии генов компетенции M.gallisepticum

Тетрациклин индуцирует экспрессию генов рекомбинации

Эксперимент по трансформации К 5 мл клеток добавляем тетрациклин (8 мг/мл) Инкубируем 15мин на 37С Осаждаем и ресуспендируем в HEPES-sucrose буфере (3 раза) Добавляем 5 мкг плазмиды pGTLori с промотором gapd под tetM Электропарация Высаживаем на полужидкую селективную среду с тетрациклином (4 мг/мл)

Планы на будущее Эксперимент по трансформации MGA обработанной рестриктазами геномной ДНК M.gallisepticum устойчивой к ципрофлоксацину.

Спасибо за внимание!