АТА-тест функциональной активности альбумина – инновационный метод диагностики и мониторинга лечения гнойно-септических осложнений, злокачественных новообразований Владимир Муравский Альбутран, Минск

О методе спиновых зондов ЭПР Строение и функции альбумина ЭПР-метод исследования альбумина История создания АТА-теста Информативность при диагностике злокачественных новообразований Информативность при диагностике гнойно- септических осложнений Содержание

Спиновый зонд – молекула со стабильным свободным радикалом, которая способна связываться с другими молекулами.Спиновый зонд – молекула со стабильным свободным радикалом, которая способна связываться с другими молекулами. Воздействие сильным магнитным полем и микроволновым излучением вызывает резонанс спиновой пробы. Ее резонансный отклик отражает размеры и свойства той части молекулы, в которой находится спиновая проба.Воздействие сильным магнитным полем и микроволновым излучением вызывает резонанс спиновой пробы. Ее резонансный отклик отражает размеры и свойства той части молекулы, в которой находится спиновая проба. Электронный парамагнитный резонанс – это техника измерения и интерпретации резонансного отклика свободных радикалов.Электронный парамагнитный резонанс – это техника измерения и интерпретации резонансного отклика свободных радикалов. ___________________________________________________________ Спектроскопия ЭПР спиновых зондов широко применяется в фундаментальных исследованиях структуры и взаимодействий белковСпектроскопия ЭПР спиновых зондов широко применяется в фундаментальных исследованиях структуры и взаимодействий белков Спектроскопия ЭПР спиновых зондов

Спиновый зонд (меченый стеарат) связывается на альбумине в двух позициях: - в специфических центрах связывания, где его подвижность ограничена - в специфических центрах связывания, где его подвижность ограничена - в пространстве между доменами альбумина внутри глобулы белка - в пространстве между доменами альбумина внутри глобулы белка Связывание спинового зонда на альбумине ЭПР-тест позволяет оценить модификацию конформации белка

ACADEMIC Press, New York (1995) P. 33 / Fig. 2-7 (X-ray crystallography) P. 33 / Fig. 2-8 (model picture front (a), back (b), side (c + d) views) P. 66 / Fig (conformation change under pH-transition) S. Curry / H. Mandelkow P. Brick / N. Franks – et. al. Crystal structure of HSA … Theodore Peters Jr. – All about Albumin Молекула альбумина имеет подвижную конформацию и проявляет аллостерические эффекты при взаимодействии с лигандами

«АТА-тест» - лабораторная система для исследования функциональной активности альбумина методом ЭПР Исследуемый материал: 50 мкл сыворотки или плазмы ЭДТА Время измерения пробы: 4 мин Процедура исследования (25-30 мин): (1) Забор венозной крови (2) Центрифугирование пробы крови для получения сыворотки (3) Смешивание пробы сыворотки с реактивом спинового зонда (4) Инкубация пробы в шейкере 10 мин при 37 °С (5) Набор пробы в капилляр (6) Измерение и анализ ЭПР-спектра пробы на Анализаторе (7) Вывод результата анализа Лабораторный Анализатор «ЭПР АХМ-09» 530 x 500 x 300 мм 3, 60 кг, 500 Вт Наборы реагентов «АТА-тест» - «АТА-тест-Т-20» для диагностики септических осложнений и интоксикаций - «АТА-тест-С-20» для диагностики активности злокачественного роста

После Чернобыльской катастрофы (26 апреля 1986 г.) 70% радиоактивных осадков выпали на территории БеларусиПосле Чернобыльской катастрофы (26 апреля 1986 г.) 70% радиоактивных осадков выпали на территории Беларуси Ожидалось, что последствием для облученной популяции Беларуси будет рост онкологических заболеванийОжидалось, что последствием для облученной популяции Беларуси будет рост онкологических заболеваний Разработка методов ранней диагностики онкологических заболеваний была определена как приоритетная задача для Министерства здравоохранения и Научно-исследовательского института онкологии и медицинской радиологии БеларусиРазработка методов ранней диагностики онкологических заболеваний была определена как приоритетная задача для Министерства здравоохранения и Научно-исследовательского института онкологии и медицинской радиологии Беларуси Широкие онкологические исследования были инициированы в Беларуси. Оценивались известные и новые лабораторные методы, которые могли выявить метаболические нарушения у облученных, и новые подходы к диагностике злокачественных новообразований.Широкие онкологические исследования были инициированы в Беларуси. Оценивались известные и новые лабораторные методы, которые могли выявить метаболические нарушения у облученных, и новые подходы к диагностике злокачественных новообразований. ЭПР-тест альбумина: история

Предварительные (поисковые) клинические исследования Клиническое исследование (1824 пациента, 1990 – 1999) для выявления эффективных онкомаркеров включало ЭПР-исследование альбумина 745 пациентов с раком легкого 373 пациентов с раком желудка 294 пациента с раком толстого кишечника 412 пациента с различными хроническими незлокачественными заболеваниями Большинство изученных биохимических показателей имели достоверные различия в исследованных группах, но диагностическая точность каждого из показателей не превышала 69%, за исключением опухоль-ассоциированных антигенов. Наибольшую диагностическую информативность показали опухоль-ассоциированные антигены и ЭПР-тест альбумина 93%91%95% ЭПР-тест альбумина (Оценка потенциала ЭПР-теста) 74%59%89% Нейрон-специфическая еналаза Нейрон-специфическая еналаза (NSE) 75%63%87%РЭА Диагностическая точность Диагностическая специфичность Диагностическая чувствительность Диагностика рака легких

Вопросы поставленные после предварительных исследований: Что наблюдалось при исследовании методом ЭПР альбумина больных раком? 1) Влияние других сывороточных белков или пептидов? 2) Нарушение структуры альбумина? 3) Обнаруживаются ли подобные изменения альбумина другими методами? Результаты исследований другими методами (двойная хроматография, ЖКХ) также указывали на модификацию конформации альбумина у больных раком. Результаты исследований другими методами (двойная хроматография, ЖКХ) также указывали на модификацию конформации альбумина у больных раком. 4) Можно ли найти в сыворотке больных раком уникальный специфический метаболит, связанный или отсутствующий на альбумине? Модификация сывороточного альбумина у больных раком?

Center for Applied Proteomics and Molecular Medicine, College of Arts and Sciences, George Mason University, Manassas Serum peptidome for cancer detection: spinning biologic trash into diagnostic goal The Journal of Clinical Investigation, January 2006 This view of the LMW peptidome is one in which low-abundance peptide biomarkers produced from specific and ongoing tumorigenic processes such as apoptosis, tumor-stromal interaction, vascularization, immune cell infiltration, and antigenic processing exist in a sequestered state, complexed to highly abundant resident blood proteins such as albumin Пептидные биомаркеры с низкой концентрацией в крови, продуцируемые специфическими прогрессирующими онкогенными процессами, такими как апоптоз, опухоль-стромальное взаимодействие, васкуляризация, инфильтрация иммунных клеток и антигенные реакции, находятся в изолированном состоянии - связанными на изобильных белках крови, таких как альбумин.Пептидные биомаркеры с низкой концентрацией в крови, продуцируемые специфическими прогрессирующими онкогенными процессами, такими как апоптоз, опухоль-стромальное взаимодействие, васкуляризация, инфильтрация иммунных клеток и антигенные реакции, находятся в изолированном состоянии - связанными на изобильных белках крови, таких как альбумин. Lance A. Liotta and Emanuel F. Petricoin

Альбумин – основной транспортный белок сыворотки

Альбумин: 5 г/кг массы тела (дневной синтез: 0,2 г/кг) Интраваскулярная часть (40%) 2 г/кг МТ Капилляры с высокой проходимостью ТКО ТКО = Транс-Капиллярный Обмен (прибл. 4%/час из интраваскулярной части) В течение 24 часов весь альбумин из интраваскулярной части покидает циркуляторную систему и возвращается обратно через лимфатический дренаж в кишечнике. Экстраваскулярная часть (60%) 3 г/кг МТ Капилляры с низкой проницаемостью Пул I (Кишечник) Период полувыведения 3 часа Пул II (Мышцы, кожа) Период полувыведения 24 h

ТРАНСПОРТНЫЙ БЕЛОК для: Онкотическое давление АЛЬБУМИН - Транспорт жирных кислот (питание клеток) - Транспорт лекарств Функции альбумина Аккумулирование биомаркеров - Перенос медиаторов, интермедиаторов - Эвакуация гидрофобных токсинов

Альбумин выполняет различные действия при транспорте метаболитов (1) Связывание метаболита (3) Отдача клетке- мишени (2) Перенос в системе циркуляции Действия молекулы Альбумина при переносе метаболитов: Способность молекулы альбумина изменять параметры связывания метаболитов – основа функциональности альбумина как транспортного белка

Исследование альбумина методом ЭПР (АТА-тест) позволяет выявить нарушение Исследование альбумина методом ЭПР (АТА-тест) позволяет выявить нарушение функциональной активности альбумина Способность альбумина изменять конформацию и характеристики связывания - определяет способность белка выполнять транспортные операции с метаболитами (функциональную активность) Способность альбумина изменять конформацию и характеристики связывания - определяет способность белка выполнять транспортные операции с метаболитами (функциональную активность) Патологические процессы могут приводить к нарушению функциональной активности альбумина Патологические процессы могут приводить к нарушению функциональной активности альбумина Основания для АТА-теста альбумина

Апробация ЭПР-теста альбумина (онкология) КоличествоСпецифичность Практически здоровые лица58598% Пациенты с хроническими заболеваниями12873% КоличествоЧувствительность Больные раком, всего55490% Гастроинтестинальные заболевания8493% рак легких2696% рак молочной железы3187% рак простаты8290% неходжинская лимфома3995% злокачественные лимфомы2391% плазмоцитома3497% лейкемия3187% другие виды рака20488% Пробы сыворотки/плазмы 1267 пациентов исследовали слепым методом: 585 практически здоровых лиц (доноры плазмы и крови, добровольцы) 128 пациентов с хроническим незлокачественными заболеваниями 554 больных раком до лечения

Распределения значений показателя в группах пациентов 1267 проб исследованы слепым методом здоровых лиц пациентов с хроническими заболеваниями больных раком Граница DR < 1, Здоровые лицаПациенты с хроническими заболеваниями Больные раком DR

ЭПР-тест проб сыворотки доноров, у которых в последующем был диагностирован рак пробы сыворотки 49 доноров, у которых позднее был диагностирован рак - локализация опухолей: молочная железа, простата, почки, мочевой пузырь, яички, кишечник, желудок, кожа, легкие, глаз, гипофиз Период времени от забора пробы до диагностики рака Число пациентов Положительный результат теста% до12 месяцев от 13 до 24 месяцев от 25 до 36 месяцев231356

Диагностика и мониторинг Пациент: женщина, 35 лет, злокачественная лимфома, Лимфома была обнаружена по ЭПР-тесту, диагностирована клинически. Эффективная химиотерапия. ЭПР-тест отражал эффект терапии. Корреляция с течением заболевания подтверждена клиническими данными.

Пациент: женщина, рак толстой кишки, 2002 Мониторинг лечения

Пациент: мужчина, рак толстой кишки, 2002 Мониторинг лечения

пациент: женщина, 45 лет, рак молочной железы, Мониторинг лечения

Пациент: женщина, рак молочной железы (1991). Рецидив и терапия в Рецидив-контроль

Пациент: мужчина, 67 года, рак молочной железы (февраль 2003) Рецидив-контроль

Модификация альбумина (ЭПР-тест) Модификация альбумина (ЭПР-тест) коррелирует с прогрессированием опухоли течение заболевания прогрессированием опухоли и отражает течение заболевания

Выводы В исследованиях, включавших более 2000 пациентов с различными видами злокачественных опухолей, было установлено, что у больных раком обнаруживается специфическая модификация сывороточного альбумина, что делает возможным раннюю диагностику онкологических заболеваний с чувствительностью 90% и специфичностью 90%.В исследованиях, включавших более 2000 пациентов с различными видами злокачественных опухолей, было установлено, что у больных раком обнаруживается специфическая модификация сывороточного альбумина, что делает возможным раннюю диагностику онкологических заболеваний с чувствительностью 90% и специфичностью 90%. При мониторинге пациентов, у которых пробы сыворотки исследовали периодически в течение противоопухолевой терапии, было установлено, что степень модификации альбумина коррелирует с клиническим состоянием пациента и отражает эффект терапии.При мониторинге пациентов, у которых пробы сыворотки исследовали периодически в течение противоопухолевой терапии, было установлено, что степень модификации альбумина коррелирует с клиническим состоянием пациента и отражает эффект терапии. Степень модификации альбумина коррелирует с активностью злокачественного роста и, вероятно, определяется скоростью продуцирования метаболитов клетками опухоли.Степень модификации альбумина коррелирует с активностью злокачественного роста и, вероятно, определяется скоростью продуцирования метаболитов клетками опухоли. ЭПР-тест альбумина – инновационный неинвазивный метод диагностики, демонстрирующий высокую информативность при диагностике онкологических заболеваний и в мониторинге противоопухолевой терапии.ЭПР-тест альбумина – инновационный неинвазивный метод диагностики, демонстрирующий высокую информативность при диагностике онкологических заболеваний и в мониторинге противоопухолевой терапии.

5/25/ Диагностика и мониторинг гнойно-септических осложнений Информативность ЭПР-исследования функциональной активности сывороточного альбумина Апробация ЭПР-теста альбумина (ГСО)

Транспортные функции альбумина (1) Связывание (3) Передача клеткам-мишеням (2) Перенос в цирку- ляторной системе (1) Связывание (2) Перенос в цирку- ляторной системе Доставка метаболитов: Связывание и эвакуация токсинов: Фильтрация в гепатоцитах

Альбумин- основной транспортный белок сыворотки

5/25/ пациента отделения реанимации (99 проб) наблюдавшихся после хирургической операции начиная с первого дня (некоторые - до 30 дней): 8 пациентов с ГСО (5 умерли, 3 выжили) 9 пациентов с перитонитом, пневмонией, эмпиемой и т.п. (все выжили) 5 пациентов без осложнений (контрольная группа) Параллельно с ЭПР-тестом анализировали: Лейкоциты, нейтрофилы, общий белок, альбумин, билирубин, АСТ, АЛТ, амилазу, прокальцитонин, SOFA, APACHE II, SIRS Апробация ЭПР-теста в диагностике ГСО

5/25/ Средние значения в группах пациентов для показателей, измеренных в первый и второй день наблюдения: Прокальцитонин (PCT): ЭПР-тест (DTE): Апробация ЭПР-теста в диагностике ГСО Достоверность различий в группах (тест Стьюдента) :

5/25/ Пациент после релапаротомии Диагноз (ICU): Сепсис, E.faecium, из дренажа Cholangiostoma Острая печеночная недостаточность, Энцефалопатия ЭПР-тест (DTE) Антибиотики: TIENAM 2 g/day, VANCOMYCIN 2 g/day Пациент выжил Апробация ЭПР-теста в диагностике ГСО

5/25/ Пациент: Лимфома с поражением левого легкого Диагноз ICU: Септический шок, из плевральной полости– Candida alb., Candida spp. Антибиотики: FUNGIZONE 25 mg/day пациент умер ЭПР-тест (DTE) Апробация ЭПР-теста в диагностике ГСО

5/25/ Паицент: Трансплевральная гастрэктомия. Резекция нижней части пищевода, субтотальная резекция поджелудочной железы. Спленэктомия. Резекция левого надпочечника. Резекция диафрагмы. Терапия: Инфузии плазмы, альбумина. Гемосорбция пациент выжил Апробация ЭПР-теста при диагностике ГСО ЭПР-тест (DTE)

5/25/ Заключение по исследованию: Снижение детоксикационной функции сывороточного альбумина (ЭПР-тест) в первый и второй дни после операции наблюдалось у всех обследованных пациентов: - до 30 – 70% у пациентов без осложнений; - до 1 – 20% у пациентов с ГСО. Наблюдавшиеся различия были статистически достоверны. Другие лабораторные показатели, включая прокальцитонин, в первый и второй дни наблюдения не показали достоверных различий в группах пациентов. Вариации параметра ЭПР-теста у всех пациентов достоверно отражали течение заболевания. Апробация ЭПР-теста в диагностике ГСО

«АТА-тест» - лабораторная система для исследования функциональной активности альбумина методом ЭПР Исследуемый материал: 50 мкл сыворотки или плазмы ЭДТА Время измерения пробы: 4 мин Процедура исследования (25-30 мин): (1) Забор венозной крови (2) Центрифугирование пробы крови для получения сыворотки (3) Смешивание пробы сыворотки с реактивом спинового зонда (4) Инкубация пробы в шейкере 10 мин при 37 °С (5) Набор пробы в капилляр (6) Измерение и анализ ЭПР-спектра пробы на Анализаторе (7) Вывод результата анализа Лабораторный Анализатор «ЭПР АХМ-09» 530 x 500 x 300 мм 3, 60 кг, 500 Вт Наборы реагентов «АТА-тест» - «АТА-тест-Т-20» для диагностики септических осложнений и интоксикаций - «АТА-тест-С-20» для диагностики активности злокачественного роста

Онкология: - диагностика злокачественного роста - мониторинг терапии (оценка эффекта лечения) - контроль рецидивов ГСО: - прогнозирование развития - диагностика - мониторинг лечения - оптимизация терапии Гестоз: - доклиническая диагностика - мониторинг лечения Фармацевтика: - контроль качества альбумин-содержащих препаратов - оптимизация технологии производства препаратов альбумина и плазмы Перспективные области применения АТА-теста