1 Основы метода Полимеразной Цепной Реакции (ПЦР) ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии (ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора)

2 Строение нуклеиновых кислот Нуклеиновые кислоты ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота. Содержит генетическую информацию. РНК рибонуклеиновая кислота, участвует в синтезе белка. Нуклеотиды – мономеры, из которых состоят нуклеиновые кислоты.

3 ДНК- структура Генетический материал в человеческой клетке представлен двойной цепью ДНК, содержащей в целом 3 миллиарда пар оснований. Если нить ДНК вытянуть, то ее длина составит около 2 метров.Примечательно, что ДНК настолько компактно свернута в спираль, что в составе клеточного ядра ее диаметр составляет тысячную миллиметра. Две нити ДНК свернуты таким образом, что они формируют двойную спираль. В свою очередь, эта двойная спираль также свернута в спираль с тем, чтобы она могла разместиться внутри клетки.

4 Строение нуклеотидов Каждый нуклеотид состоит из фосфатной группы, пятиуглеродного сахара ( пентозы) и азотсодержащего основания. Когда нуклеотиды полимеризуются фосфатная группа одного нуклеотида связывается с сахаром другого нуклеотида, а последний в свою очередь ковалентно связан с молекулой азотистого основания. Нуклеотиды – присоединяются друг к другу таким образом, что фосфатная группа одного присоединяется ковалентно к сахару другого и образуют сахаро-фосфатный остов молекулы. Азотистые основания располагаются по одну сторону от него.

5 Строение нуклеотидов

6 Состав нуклеотидов Дезоксиаденозинтрифосфат = д АТФДезоксигуанозинтрифосфат = дГТФ Дезоксицитидинтрифосфат = д ЦТФДезокситимидинтрифосфат = дТТФ

7 Образование цепи ДНК 5-G-A-A-T-C-T-A-C-A-3

8 Образование двухцепочечной ДНК. Принцип комплементарности. дЦМФ дГМФ д ТМФдАМФ дГМФ дЦМФ д АМФдТМФ

9 Комплементарность Комплементарность – последовательность нуклеотидов в одной цепи автоматически определяет строго соответствующую ей последовательность нуклеотидов в комплементарной ей цепи.Так азотистое основание Аденин (А) всегда взаимодействует только с комплементарным ему азотистым основанием Тимин (Т) в молекулах ДНК. Комплементарность оснований обеспечивается системой водородных связей

10 Функции ДНК 1. ДНК является носителем генетической информации. Функция обеспечивается фактом существования генетического кода. 2. Воспроизведение и передача генетической информации в поколениях клеток и организмов. Функция обеспечивается процессом репликации. 3. Реализация генетической информации в виде белков, а так же любых других соединений, образующихся с помощью белков- ферментов.Функция обеспечивается процессами транскрипции и трансляции.

11 Полимеразная цепная реакция для детекции РНК Геномы некоторых вирусов, имеющих большое клиническое значение, состоят не из ДНК, а из РНК. Наиболее значимые из них – вирусы иммунодефицита человека (ВИЧ), гепатита с (ВГС) и семейство энтеровирусов

12

13 Рибонуклеиновая кислота 5-G-C-U-A-3 Химическая структура РНК по сравнению с ДНК отличается двумя особенностями. Во- первых, вместо присутствующего в ДНК тимидина в РНК содержится урацил, в котором СН 3 -группа при одном из атомов углерода заменена водородом. Во-вторых, в сахаре РНК, рибозе, к 2- углероду присоединена ОН- группа, а не атом водорода, как в дезоксирибозе, входящей в состав ДНК. При синтезе РНК и ДНК 5-конец присоединяемого нуклеотида (в данном случае аденозинтрифосфата) взаимодействует с 3- гидроксилом последнего в цепи нуклеотида с образованием фосфодиэфирной связи (отщепляется пирофосфат).

14 Репликация ДНК Определение : процесс, осуществляемый комплексом ферментов и белков, выполняющих топологическую функцию, суть которого в образовании идентичных копий ДНК для передачи генетической информации в поколениях клеток и организмов, называют репликацией ДНК.

15 Механизм репликации ДНК в клетке

16 Центральная догма молекулярной биологии Генетическая информация сначала переводится на язык рибонуклеотидов (ДНК транскрибируется в РНК), а затем – аминокислот (РНК транслируется в белки). Гены – это только те сегменты ДНК, которые кодируют белки

17 Геном как фундаментальный таксономический признак Структурная организация генома является фундаментальным таксонмическим признаком,лежащими в основе систематики животного и растительного мира. В соответствии со структурной организацией генома все живые организмы разделяютя на два надцарства: прокариот и эукариот. К прокариотам относят организмы, геном которых не заключен в ядро, ограниченное ядерной мембраной, и его редупликация не сопровождается митозом. Клетки эукариот содержат оформленное ядро, и редупликация их генома сопровождается митозом. Митоз-деление клеточного ядра, при котором образуются два дочерних ядра с наборами хромосом, идентичными наборам родительской клетки.

18 РЕГУЛЯЦИЯ РАБОТЫ ГЕНОВ У ПРОКАРИОТ Геномная ДНК прокариот почти целиком состоит из белок-кодирующих генов. Они служат матрицами для синтеза РНК, которые немедленно транслируются в белки. Последние регулируют работу генов и выполняют другие функции в клетке. ТРАДИЦИОННЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ О РЕГУЛЯЦИИ РАБОТЫ ГЕНОВ У ЭУКАРИОТ Гены у эукариот состоят из экзонов - последовательностей, каждая из которых кодирует часть белковой молекулы, и интронов - некодирующих участков. Транскрипции подвергается ген целиком, но затем из первичного транскрипта вырезаются интронные РНК, а экзонные РНК сшиваются друг с другом с образованием матричной РНК (мРНК). На ней синтезируется белок, а интронная РНК расщепляется за ненадобностью.

19 НОВЫЙ ВЗГЛЯД НА РЕГУЛЯЦИЮ РАБОТЫ ГЕНОВ ЭУКАРИОТ Некоторые интронные РНК и даже часть экзонных принимают участие в регуляции работы генов, связываясь с молекулами ДНК, другими РНК и белками. Воздействуя на синтез белков на различных уровнях, некодирующие РНК могут служить дополнительным источником генетической информации.

20 Репликация ДНК в клетке – прообраз Полимеразной Цепной Реакции. Полимеразная цепная реакция достаточно точно повторяет принципы естественной репликации ДНК. ПЦР представляет собой трехступенчатый процесс (цикл), который повторяется заданное количество раз

21 Основные компоненты ПЦР- смеси Буферный раствор Mg ++ Праймеры дНТФ ДНК-полимераза (Taq, Tth) Исследуемый препарат ДНК

22 Олигонуклеотидные праймеры из подобранной пары должны быть комплементарны противоположным цепям ДНК и при этом ограничивать выбранный участок так, что при их ферментативном удлинении вновь синтезируемые цепи ДНК будут расти навстречу друг другу. Из этого следует, что для выбора, и синтеза самих олигонуклеотидных праймеров исследователю должна быть известна какая-то часть последовательности ДНК в выбранных регионах. (Случаи использования в качестве затравочных молекул праймеров с произвольной выбранной последовательностью нуклеотидов не рассматриваются). Кроме того, на праймеры накладывается масса других ограничений с целью исключения их нежелательной гомологии, формирования вторичной структуры, при этом необходимо учесть также температуры отжига каждого из них на матрице ДНК. Все это достаточно подробно рассматривается в специальной температуре. Более того, существует множество специальных компьютерных программ, позволяющих выбрать наиболее оптимально подходящие праймеры для каждого эксперимента.

23 Праймеры - основа специфичности ПЦР ДНК - мишень ATGGTA Праймер - F GAACCCTTACGGCA CTTGGGAATGCCGT TACCATTGGGCAAGGTACCATGGTAACCCGTTCC Праймер - R GAACCCTTACGGCA ATGGTAACCCGTTCCATGGTACCATTGGGCAAGG ATGGTAACCCGTTCC AGGTACC 5` 3`

24 Анализ нуклеотидных последовательностей микроорганизмов для выбора праймеров

25 Термостабильная ДНК- полимераза – основа автоматизации цикличности ПЦР

26 Что касается фермента ДНК-полимеразы, то, несмотря на то, что в первых опытах по амплификации ДНК это был простой Кленовский фрагмент ДНК-полимеразы I и его использование для этой цели принципиально возможно и сейчас, в настоящее время необходимо применять термостабильные ДНК-полимеразы, выдерживающие температуру 95 о С в течение значительного промежутка времени. Периодический нагрев реакционной смеси до столь высокой температуры вызван циклическим характером протекания реакции амплификации ДНК и предназначен для денатурации цепей ДНК (как исходных, так и вновь синтезированных).

27 ДНК - полимераза ДНК-полимераза – это фермент, способный наращивать короткие цепочки ДНК, так называемые олигонуклеотидные праймеры, если эти короткие цепочки связаны с более длинной «матричной цепью» ДНК. При этом полимераза присоединяет к 3 – концу связанного праймера соответствующий комплементарный нуклеотид

28 4 дезоксирибонуклеотида - строительный материал, который используется ДНК- полимеразой для синтеза комплементарной цепи ДНК. Буферный раствор. Смесь катионов и анионов в определенной концентрации, обеспечивающих оптимальные условия для реакции, а также стабильное значение рН. Mg ++. Используется диапазон рабочих концентраций mM. Увеличение концентрации Мg++ оказывает очень резкое влияние на специфичность и эффективность ПЦР.

29 Этапы ПЦР Денатурация ДНК (95 о С) Отжиг праймеров (55-65 о С) Полимеризация цепей ДНК (72 о С)

30 Цикличность реакции амплификации Отжиг праймеров Полимеризация Денатурация Отжиг праймеров Полимеризация Денатурация Отжиг праймеров Полимеризация Денатурация Отжиг праймеров Полимеризация Денатурация Отжиг праймеров Полимеризация Денатурация Отжиг праймеров Полимеризация Денатурация Отжиг праймеров Полимеризация Денатурация Отжиг праймеров Полимеризация Денатурация Отжиг праймеров Полимеризация Денатурация N=1 N=40 N – количество циклов ПЦР

31 Программируемые термостаты (амплификаторы)

32 Накопление продукта ПЦР

33 Экспоненциальный характер накопления продуктов ПЦР Первый цикл ПЦР. ДНК-мишень фланкирована последовательностями 1- 2 в одной цепи и последовательностями 1 – 2 – в другой. К образцу ДНК добавляют праймеры (Р1 и Р2), ДНК – полимеразу Taq и четыре дезоксирибрнуклеозидтрифосфата (dNTP). Смесь нагревают до 95 о С, инкубируют в течение 1 мин и медленно охлаждают до 55 о С (температура отжига). При этой температуре праймеры, добавленные в избытке, спариваются с разделенными цепями. В этих условиях происходит синтез обеих цепей ДНК, начинающийся с 3- гидроксильных концов праймеров. Каждая из синтезированных цепей имеет гораздо большую длину, чем расстояние от 3 – гидроксильной группы «ее» праймера до концевого нуклеотида последовательности, комплементарной второму праймеру. Эти цепи служат матрицами во втором цикле ПЦР

34 Второй цикл Второй цикл ПЦР. Исходным материалом в этом случае является смесь молекул ДНК, образовавшихся в первом цикле. При отжиге праймеры гибридизуются с комплементарными им участками как исходных цепей, так и «длинных матриц», синтезированных в первом цикле. В результате ферментативного синтеза in vitro на исходных цепях синтезируются «длинные матрицы», а на «длинных матрицах» - «короткие». Последние начинаются с одного праймера, а заканчиваются последовательностью, комплементарной второму

35 Третий цикл Третий цикл ПЦР. При отжиге праймеры гибридизуются с комплементарными участками исходных цепей, а также «длинных» и «коротких» матриц. При ферментативном синтезе in vitro на исходных цепях синтезируются «длинные матрицы», а на «длинных» и «коротких» матрицах – только «короткие матрицы».

36 Тридцатый цикл Тридцатый цикл ПЦР. На этом этапе в реакционной смеси содержится практически одни короткие матрицы

37 Экспоненциальный характер течения ПЦР

38 Резюме по ПЦР Этот трехступенчатый цикл (денатурация, отжиг, удлинение цепи), занимающий 2-3 минуты, может быть повторен многократно. Этот процесс ПЦР называется амплификацией, потому, что происходит копирование изначальной последовательности и затем каждая копия, в свою очередь, копируется снова и снова, пока их число не достигнет миллионов. Каждая новая нить ДНК служит матрицей для ферментативного синтеза цепей в следующем цикле. Теоретически, каждый новый цикл удваивает количество копий ДНК; в первом цикле их образуется 2, затем 4, затем 8, затем 16, т.н происходит экспоненциальное нарастание количества копий. Это и есть Цепная реакция в методе ПЦР. Теоретически, в результате 20 циклов образуется миллион копий, в результате 30 – миллиард. ПЦР позволяет получить количество материала, достаточное для детекции ДНК.

39 Электрофорез – метод детекции продуктов ПЦР

40 Размер ампликона можно оценить, сравнив его пробег с пробегом молекул ДНК известной длины, которые входят в состав маркера для ЭФ разделения ДНК 800 п.н. 500 п.н. 400 п.н. 300 п.н. 200 п.н. 100 п.н. Маркеры Ампликоны c b a a – 800 п.н. b – 450 п.н. c – 400 п.н.

41

42 Тестирование панели контрольных образцов, содержащих хламидии 16- Внутренний контрольный образец (ВКО) 17-Положительный контрольный образец (ПКО) Клинические пробы 18-Маркер длины

43 Электрофорез в агарозном геле

44

45 М ОК ПК К+К ОК ПК К+ К- М

46 Основной принцип технологии Real-time PCR и гибридизационно-флуоресцентной детекции 1. Определение выхода продукта реакции после каждого цикла амплификации 2. Построение по этим данным кинетической кривой PCR 3. Определение относительной концентрации субстрата на основании анализа этой кривой Типы Real-time 1. Применение интеркалирующих флуоресцентных агентов, флуоресценция которых значительно возрастает при связывании с двухцепочечной ДНК. 2. Использование меченых флуоресцентными агентами олигонуклеотидных проб, комплементарных участкуPCR-продукта

47 Тест-система для измерения «вирусной нагрузки» ВИЧ, разработанная в ЦНИИ Эпидемиологии МЗ РФ -ДНК -РНК -белки -липиды -и т.д. СИЛИКА РНК промывка -белки -липиды -и т.д. Буфер для элюции + центрифугирование СИЛИКА РНК Плазма+лизирующий буфер Выделение РНК ОКО - негативная плазма человека ПКО РНК 1 - РНК ВИЧ с высокой копийностью ПКО РНК 2 - РНК ВИЧ с низкой копийностью ВКО РНК - внутренний контрольРНК

48 Основные характеристики ПЦР Высокая чувствительность, основанная на экспоненциальном принципе накопления продукта. Высокая специфичность, основанная на выявлении уникальных для микро- (макро)-организма участков генетического материала. Метод прямого выявления возбудителя, основанный на универсальности способа хранения и передачи генетической информации живой материи.

49 Этапы ПЦР-анализа Обработка клинического материала ПЦР Детекция продуктов амплификации