PRECLINICAL STUDY OF MODIFIED CARBON SP3-NANOPARTIES Prof. Dr. Stavri Yanev Stavrev, Dr. Nikolay Odintsov

Abstract In contrast to the classic detonation nanodiamond, which has a three layer covering of oxygenic, carboxylic, carbonylic, quinone, and other functional groups, the new sp3 carbon-bearing nanoparticles [1] (SP3-nanoparticles hereafter) have only a thin carbon layer, which determines their positive biological activity. Pre-clinical studies confirmed that the SP3-nanoparticles are non-toxic. They show no irritant or allergic activity, no reproductive or immunological toxicity. Their specific pharmacological activity on Leukemia P388 and L1210 (early stage of the disease), and Lewis carcinoma 3LL (late stage of the disease) was tested. The main results are as fallows: All animals of the control group died by the time of the first control point; 80%, 30% and 100% of the standard chemotherapy group respectively died by the second control point; 100% of the third group, who received combination of the standard chemotherapy and SP3- nanoparticles, was alive by the end of the study.

Введение Развитие нанотехнологий в конце 20-го и начале 21-го века родило новые надежды относительно перелома в борьбе с рядом заболеваний, превратившихся в бич для человечества: рак, коксартроз, туберкулёз и пр. Среди реально производимых наноматериалов и усвоенных промышленных нанотехнологий особое место занимают детонационное синтезированные наноалмазы, точнее, монокристаллические структуры с размером частиц в среднем 4 nm.

Введение Метод синтеза, осуществляемый во взрывных камерах (Фиг. 1), хорошо усвоен и изучен в Республике Болгарии, где единственно организовано промышленное производство. Получение детонационных наноалмазов базируется на фазовом переходе свободного углерода во взрывные вещества с отрицательным кислородным балансом в процессе взрыва, при давлении 22 г Па, температуре К и времени порядка миллисекунд. Фиг. 1

Введение Для синтеза наноалмазов и модификации поверхностей разработаны новые технологии (отражены в патентах 1, 2, 3), а полученный наноалмаз показан на фиг 2. Фиг.2

Предпосылки использования детонационного наноалмаза при лечении злокачественности 2.1. Механизм воздействия химиопрепаратов на раковые клетки и опухли Классическое лечение онкологических заболеваний имеет своей основой проведение химиотерапии. Химиопрепараты являются сильными токсинами. Вводятся интровенозно в виде растворов. После проникновения по току крови в организм химиопрепарат просачивается через мембран клеток, в том числе и раковых. Раковые клетки сигнализируют в мозг о том, что к ним проник сильный токсин. Мозг подаёт команду: «Выбрось его!». В клетке возникает т. наз. «фонтанирующий» эффект и химиопрепарат выбрасывается. В стремлении всё-таки обеспечить какое-нибудь количество химиопрепарата, с целью воздействия следует увеличение количества и в результате начинают погибать здоровые клетки. Известно, что более пятидесяти процентов больных погибают в результате химиотерапии. Поэтому исследования направлены на обеспечение «прицельной» химиотерапии, т.е. направление только на раковые клетки и предотвращение ими выброса химиопрепарата.

Предпосылки использования детонационного наноалмаза при лечении злокачественности 2.2. Свойства детонационнного наноалмаза, определяющие пригодность для лечения онкологических заболевании Пригодность детонационного наноалмаза при лечении злокачественности определяется его следующими свойствами: Сверхвысокая поверхностная активность благодаря некомпенсированным связям поверхностных атомов. Это позволяет на поверхности закрепляться небольшому количеству химиопрепарата,т.е. наноалмаз является превосходной транспортной системой. Наноразмеры частиц /2 – 4 мм/, что определяет их невидимость защитой организма – макрофагами, т.е. они не атакуются клеточным иммунитетом и свободно проникают через мембрану раковых клеток. Не вызывают аллергических реакций.

Предпосылки использования детонационного наноалмаза при лечении злокачественности Частицы наноалмаза ищут раковые клетки по повышенной кислотности / на 2,5 выше/, т.е. реализуется прицельная химиотерапия. Этот механизм точнёе при наших исследованиях и показан на фиг.3. В чистом виде наноалмазные частнцы инициируют явление апоптоза, при котором активируется автономная реакция: задействуются киллеры раковых клеток –Т-лимфоциты. При этом разрушаются наиболее активно размножающиеся клетки опухоли. предохраняются здоровые клетки.

Предпосылки использования детонационного наноалмаза при лечении злокачественности Фиг. 3

Предпосылки использования детонационного наноалмаза при лечении злокачественности 2.3. Механизм воздействия наноалмаза и химиопрепарата Этот механизм показан на фиг.4 (согласно 6) Сущность механизма воздействия: нагруженная химиопрепаратом алмазная наночастица после введения в организм перорально илт интравенозно попадает по току крови в раковые клетки в результате различной кислотности. Наночастица проникает через мембрану клетки и вследствие высокой адгезии приклеивается к её стенке очень прочно. Фиг. 4

Предпосылки использования детонационного наноалмаза при лечении злокачественности Прочное прикрепление предотвращает выброс частицы по механизму фонтанирующего эффекта. Раковая летка погибает и выводится из организма естественным путём. Не наблю Прочное прикрепление предотвращает выброс частицы по механизму фонтанирующего эффекта. Раковая летка погибает и выводится из организма естественным путём. Не наблюдается воздействие на здровые клетки. Обеспечивается возможность уменьшения количества препарата до 40 раз, т.е. сокращается количество препарата до безопасных для организма уровней. обеспечивается возможность непрерывного воздействия до полного вылечивания. Комплекс является сверхактивным сорбентом и обеспечивает детоксификацию организма.дается воздействие на здровые клетки. Обеспечивается возможность уменьшения количества препарата до 40 раз, т.е. сокращается количество препарата до безопасных для организма уровней. обеспечивается возможность непрерывного воздействия до полного вылечивания. Комплекс является сверхактивным сорбентом и обеспечивает детоксификацию организма.

Доклинические исследования Вышеперечисленные свойства наноалмаза. Констатированные при наших исследованиях являются надежной основой безопасности при лечении злокачественности. Эти исследования осуществлены по нашей заявке и договору в Институте по токсикологии и в Институте по радиологии в г. Обнинске – РФ.

Доклинические исследования 3.1. Изучение острой токсичности а/ Изучение острой токсичности на грызунах 2 х 12 шт. б/Исследования острой токсичности на негрызунах /на собаках/ 2 х 12 шт Исследования субхронической токсичности а/ на грызунах шт. б/ на негрызунах – 30 щт. плюс 12 шт. – контрольная группа 3.3. Исследование раздражающего местного действия: 12 крыс плюс 12 собак 3.4. Изучение эмбриотоксического действия и влияние на репродуктивную функцию: 2 х 12 животных 3.5. Изучение возможного иммунотоксического и аллергенного действия: а/ оценка иммунотоксичности - крысы по линии СВА, 20 шт. б/ оценка аллергенности – морские свинки - 20 шт. с/ оценка специфической активности 20 животных

Доклинические исследования Использованные животные с присаженными опухолевыми клетками Мыши по линии ДБА /2/, заражённые лейкемией R 388. Мыши по линии ДБА /2/. Зараженные лейкемией L 1210 Мыши – самцы, линия С 57 ВЛ /, зараженные карцинома Люиса По трем видам рака исследованы 15 групп по 10 животных в группе. Общее количество использованных животных

Доклинические исследования Использованные животные с присаженными опухолевыми клетками Мыши по линии ДБА /2/, заражённые лейкемией R 388 Мыши по линии ДБА /2/. Зараженные лейкемией L 1210 Мыши – самцы, линия С 57 ВЛ /, зараженные карцинома Люиса По трем видам рака исследованы 15 групп по 10 животных в группе. Общее количество использованных животных Работано с введением циклофосфана, чистого наноалмаза и модифицированного алмаза с циклофосфаном на поверхности. Варьировано в комбинации с химиопрепаратами и наноалмазами.

Результаты исследований. Итоги Проведенные исследования показывают, что: Модифицированный наноалмаз /МНА/ при остром введении экспериментальным животным практически не оказывает токсического воздействия. Стоимость ЛД 50 в среднем составляет более мг на кг при оральном введении. Результаты и наблюдения исследований позволяют МНА отнести к пятому классу практически нетоксических лекарственных веществ. Применение препарата МНА при полузрелых крысах обоих полов орально, раз в сутки, в течение 30 суток в разных дозах не оказывает негативного воздействия на целостные функции организма животных и на их поведение. Применение препарата МНА при половозрелых собаках обоих полов. Орально, раз в сутки, в течение 30 суток в различных дозах практически не ведет к развитию патологических изменений общего состояния и поведения животных. МНА приоральном введении не обладает раздражительный, аллергезирующим и иммунотоксичным действием. МНА обладает способностью стимулировать хуморальный иммунный ответ, в том числе и при слабо реагирующих мышах линии С 75 В 1/ 6. МНА не влияет на развитие реакций РТПХ.

Результаты исследований. Итоги МНА не влияет на фагоцитарную активность периториальных макрофаг мышей всех линий. МНА не обладает репродуктивной токсичностью: а/ МНА не влияет на численность созревших сперматозоидов эпидидимиса и не снижает количество подвижных форм сперматозоидов, не оказывает влияние на репродуктивные функции самцов. б/ МНА не влияет на спермеогенезис крыс. в/ МНА не обладает мутагенными свойствами. г/ Введение МНА самкам крыс в дозах, соответствующих стократной терапевтической дозе для человека, не влияет на созревшие фолликулы в яичниках, на их овуляцию и оплодотворение и не ведет к дисмерфогенезе. Все показатели, регистрированные в ходе репродуктивных исследований, полностью соответствуют контрольным.

Характерные примеры исследования При совместном ведении препарата МНА структура химиотерапии циклофосфаном животным с присаженными опухолевыми клетками установлено, что ведение МНА в структуру терапии с циклофосфаном животным с присаженным и опухолевыми клетками Р 388 /лейкемия/ способствует достоверному увеличению продолжительности жизни животных в полтора раза и повышению уровня выживание на 80 % при назначении разных сроков. введение МНА в структуру терапии циклофосфаном животным с присаженными опухолевыми клетками Л1210 (лимфолейкоз) способствуют достоверному увеличению продолжительности жизни животных в 1,2 раза и повышению уровня выживаемости на 30 % при назначении в течение трёх дней после присадки клеток. введение МНА в структуру терапии циклофосфаном животным с присадками опухолевых клеток 3ЛЛ /карцинома Люиса/ способствует продлению жизни животных в 1,2 раза и повышению уровня выживаемости на 100% при его предварительном введении с 21-ого дня и совместном назначении на 37 –ой день после присадки опухолевых клеток. Институт по токсикологии г. Санкт-Петербурга, после проведенного исследования рекомендовал препарат МНА МЗСРРФ в качестве нетоксичного лекарственного средства с целью получения разрешения проведения клинических испытаний для медицинского применения.