Выполнила: Бучкова А.Э., студентка ЕГФ 4 курса гр.5102 Проверил: Сазонов В.Ф., к.б.н., доцент

Дифференциальное центрифугирование (differential centrifugation) [лат. differentia различие; лат. centrum средоточие, центр и fuga бегство, бег] метод разделения субклеточных частиц по их коэффициентам седиментации, которые приблизительно пропорциональны размерам.

Начало методу было положено в 1926 г., когда Теодор Сведберг изобрел аналитическую центрифугу и использовал ее для определения молекулярной массы гемоглобина. После этого разделение клеточных компонентов стало вполне реальным. Теодор Сведберг (1884 – 1971 гг.) – шведский химик

Роторы Центрифуга Центрифуга предназначена для разделения веществ в центробежном поле. Роторы (центрифужные пробирки) разгоняются автоматически до заданной скорости. Имеется система защиты роторов от превышения максимально допустимой скорости. Погрешность измерения скорости ±1%. Время работы центрифуги может быть задано до 6 ч с точностью ±5 мин.

Прежде, чем подвергнуть клетки центрифугированию, необходимо разрушить жесткий каркас клеточных оболочек. Существуют следующие методы: 1. Применение гипотонического солевого раствора: при набухании клеток мембраны лопаются, при этом повреждаются мембраны клеточных органелл; 2. Применение гомогенизатора Поттера-Эльвеймана: клетки лопаются под влиянием разрывающих сил во время многократного прохождения между стенкой пробирки и вращающимся пестиком, клеточные органеллы остаются целыми; 3. Французский пресс: клетки сначала подвергают высокому давлению в камере с азотом, при резком снятии давления пузырьки газа разрывают клеточную мембрану, органеллы клетки не подвергаются воздействию.

1)Гомогенизированную ткань центрифугируют при малой скорости, что приводит к осаждению ядерной фракции (содержащей ядро и неразрешенные клетки) и отделению супернатанта (1). 2)Супернатант осторожно сливают (декантируют) и проводят центрифугирование при более высокой скорости, разделяются митохондриальная фракция (содержащая митохондрии, лизосомы и пероксисомы) и супернатант (2). 3)Последний декантируют и центрифугируют при высокой скорости, формируется микросомальная фракция (содержащая смесь свободных рибосом и фрагментов гладкого и шероховатого ЭПР) и отделяется чистый прозрачный раствор конечный супернатант (3). 4)Супернатант (3) представляет собой цитозоль, или клеточный сок. Этапы центрифугирования

Схема, иллюстрирующая последовательные этапы центрифугирования клетки

п/п Скорость (где g – ускорение силы тяжести ) Время Полученная фракция 1. Низкая (600 g)10 мин Ядра, цитоскелет 2. Средняя (1000g)15 мин Хлоропласты 3. Высокая (10000g)30-60 мин Митохондрии, рибосомы, микротельца 4. Очень высокая (150000g)60 мин Рибосомы

Заключение Работая с фракциями внутриклеточных структур, можно установить детальный молекулярный механизм биологических процессов, так как в этом случае механизм исследуется без помех, создаваемых происходящими в клетке побочными реакциями. Чистые фракции внутриклеточных структур можно подвергать любым видам анализа.