Пептидергическая регуляция функций поджелудочной железы при возрастной патологии Tarnovskaya Svetlana Saint Petersburg Institute of Bioregulation and Gerontology

Возрастная патология поджелудочной железы С возрастом физиологическая активность эндокринных клеток поджелудочной железы (инсулинпродуцирующих β-клеток, глюкагонпродуцирующих α-клеток и соматостатинпродуцирующих δ- клеток) снижается, что приводит к развитию сахарного диабета 1-го и 2- го типов.

Регуляция дифференцировки клеток поджелудочной железы (Joel F. Habener, Daniel M. Kemp, and Melissa K. Thomas. Minireview: transcriptional regulation in pancreatic development // Endocrinology. 146(3): , 2005)

Тетрапептид Lys-Glu-Asp-Trp Снижение уровня глюкозы в крови Тетрапептид Lys-Glu-Asp-Trp Крысы с сахарным диабетом, вызванным введением аллоксана Пациенты с сахарным диабетом 1 го и 2 го типов

Цель исследования: изучить влияние тетрапептида Lys-Glu-Asp-Trp на экспрессию факторов дифференцировки эндокринных клеток поджелудочной железы человека. Задачи: 1. Оценить возрастную динамику экспрессии сигнальных молекул – маркеров дифференцировки клеток поджелудочной железы при старении 2. Изучить влияние тетрапептида Lys-Glu-Asp-Trp на экспрессию указанных маркеров при старении клеток поджелудочной железы методами иммуноцитохимии

Материалы и методы Диссоциированное культивирование Объект исследования: культура клеток поджелудочной железы человека получена из 14 недельного плода, умершего антенатальной. 1 пассаж – «молодые» культуры, 14 пассаж – «старые» культуры. Форма опыта: Контрольные культуры клеток – контроль 1 (добавление физиологического раствора 0,9%), контроль 2 (добавление контрольного тетрапептида Ala-Glu-Asp-Leu, 20 нг/мл) Подопытные культуры клеток – добавление тетрапептида Lys-Glu-Asp-Trp, 20 нг/мл. Клетки культивировали во флаконах (25 см 2, JetBiofit) в стандартных условиях (5% СО 2, среда ДМЕМ, L-глутамин, 15% FBS SC-BIOL, 1% пенициллин-стрептомицин). В работе использовали первичные моноклональные антитела к Pax6, Nkx2.2, Pdx1 (1:50, Abcam) и вторичные антитела – биотинилированные анти мышиные иммуноглобулины (Novocastra). Для пермеабилизации использовали 0,1% тритон Х100. Визуализацию окраски проводили с применением пероксидазы хрена и деаминобензидина (EnVision Detection System). Площадь экспрессии маркеров оценивали морфометрическим методом (микроскоп Nikon Eclipse E400, цифровая камера Nikon DXM1200, ПК Intel Pentium 4, программное обеспечение «Vidеotest Morphology 5.2»).

Материалы и методы Молекулярное моделирование выполнялось с использованием лицензионного программного обеспечения Molecular Operating Environment Построение молекул Фрагмент ДНК 5-ATATGGCAGGGGTAA-33'-TATACCGTCCCCATT-5 взят из белковой базы данных (PDB) под номером 2KV6. Пептиды Lys-Glu-Asp-Trp и Ala-Glu-Asp-Leu построены в левовращающей конформации. Молекулы ДНК и пептиды протонировались при рН7, Т=300К, NaCl 0.1 моль/л и минимизировались в силовом поле Amber12:EHT. Растворитель учитывался в неявном виде как генерализованная борновская модель с диэлектрической постоянной е=80 2. Расчет ДНК-пептидных комплексов Для предсказания наиболее энергетически выгодных ориентаций пептида в молекуле ДНК и расчета энергии связи использовались алгоритмы докинга и штрафные функции London dG и GBVI/WSA dG

Исследуемый и контрольный пептиды Пептид Lys-Glu-Asp-Trp Пептид Ala-Glu-Asp-Leu (контрольный)

Влияние пептида Lys-Glu-Asp-Trp на экспрессию факторов дифференцировки клеток ПЖ Pax6 – фактор дифференцировки (ФД) α-клеток; Pdx1 – фактор дифференцировки β- клеток * - р

Влияние пептида Lys-Glu-Asp-Trp на экспрессию факторов дифференцировки клеток ПЖ Foxa2 – ФД β-клеток ; Nkx2.2 – ФД α-клеток и PP-клеток * - р

Влияние пептида Lys-Glu-Asp-Trp на экспрессию факторов дифференцировки клеток ПЖ Pax4 – ФД β-клеток; Ptf1a- ФД ацинарных клеток * - р

Влияние пептида Lys-Glu-Asp-Trp на экспрессию генов ФД ПЖ * - р

Влияние пептида Lys-Glu-Asp-Trp на экспрессию генов ФД ПЖ

* - р

Предполагаемая мишень действия пептидов PDX1 gene (или Ngn3, Pax4, Ptf1a ) mRNA

Спектры поглощения ДНК-пептидных комплексов C(Pep) = 1 mg/ml, C(DNA)=0,05 mg/ml, С(NaCl) = 0,005M

Гипотетический механизм действия коротких пептидов

Электростатические характеристики пептидов (pH 7.4, T=300 K) Ala-Glu-Asp-Leu (Ʃq = -2 ) Lys-Glu-Asp-Trp (Ʃq = 0)

Электростатические характеристики ДНК ( pH 7.4, T=300 K) Большая бороздка 5-AAAAAAAAAA-3 3-TTTTTTTTTT-5 Малая бороздка 5-AAAAAAAAAA-3 3-TTTTTTTTTT-5

Электростатические характеристики ДНК (pH 7.4, T=300 K) Большая бороздка 5-CCCCCCCCCC-3 3-GGGGGGGGGG-5 Малая бороздка 5-CCCCCCCCCC-3 3-GGGGGGGGGG-5

Электростатические характеристики ДНК (pH 7.4, T=300 K) Большая бороздка 5-ACGTACGTAC-3 3-TGCATGCATG-5 Малая бороздка 5-ACGTACGTAC-3 3-TGCATGCATG-5

Электростатические характеристики ДНК ( pH 7.4, T=300 K) Большая бороздка 5-GACCGTCAGC-3 3-CTGGCAGTCG-5 Малая бороздка 5-GACCGTCAGC-3 3-CTGGCAGTCG-5

Электростатические характеристики ДНК ( pH 7.4, T=300 K) Большая бороздка 5-GGCAGG-3 3-CCGTCC-5 Пептид Lys-Glu-Asp-Trp

Предполагаемый сайт связывания для пептида Lys-Glu-Asp-Trp Genegene regulatory region, range -499 to 100 bp (cDNA 5' 3')GenBank Pdx1 ATCAAATGCTTCTGACCTAGAGAGCTGGGTCTGCAAACTTTTTTTTTATCGTATTCCGCAACAGTTAAATAAAAAATTAAAAACTCAACATGTCTCCT TGTAAACTACATCAATTAACAAACACACTATGTCCATTATCAAATATAATAGAAAAAATATAGGAAAATAGAAAATAGAAAAATATAGGAAAATAG AAACTTTTAAGCCACGGTGAAAATGTTTCTATAAATGAGTGGTTCTAATGTTTTCGTGAGCGCCCATTTTGGGGAGCACCGCCAGCTGCCCGTTCAG GAGTGTGCAGCAAACTCAGCTGAGAGAGAAAATTGGAACAAAAGCAGGTGCTCGCGGGTACCTGGGCCTAGCCTCTTAGTGCGGCCAGCCAGGC CAATCACGGCCCCCGGCTGAACCACGTGGGGCCCCGCGGAGCCTATGGTGCGGCGGCCGGCCCGCCGGTCCGCGCTGGCTGTGGGTTCCCTCTG AGATCAGTGCGGAGCTGTCAAAGCGAGCAGGGGTGGCGCCGGGAGTGGGAACGCCACACAGTGCCAAATCCCCGGCTCCAGCTCCCGACTCCCG GCTCCCGGCTCCCGGCTCCCGGTGCCC NM_ Pax6 GGCCCGAAGCCGCCGAGAGAGCTCGGGACAGCGCAGGACCAGGCAGCCGCTCGCTCTCCTGTCACCTTAACTGCAGGCTCCGAGGGGCGCCTTT GGAGTGTACTGAGGTGTGTCCTAATCGTGCGGCATTCAACAAATGGACTTCTGGTGTGTGGTCAGAAGAGAAAAGCCATTTACTTACTTTCCTCCC CGGTTTTCTGGCAACAGCTGAAGGGGAGCTGCCTCCGTGGACTGAGCAGACCCAGGAGAGGGAGTCGTGGTGCGGAGACACACGCACCACACA CAGATGACCGGTGGCACACACGACACACGCTGACATACCGACATCGCCAGTGGGACACACACACACACACACACACACACACACACACACACAGA GAGAGAGAGAGAATCCCTCCCAGCATTGGTCATCCGCCCCCCCACCCAGGCTTCCACTCCCCCTCCCCTCTTATCTCCCCTGGCTTCCCCTCCTCTCG GGCGCTGCGAAAAGCAGCCGCACTTAGTCAACAAATGGCACGTGGGAGAAGTTGGTGAGTGTTTGGTGAGGACTCTTCAGGGCTTTTCACAAGA ACCCTCTGTACACAAAGTAAGTGGCGTGTT NM_ Pax4 GCCAGCTCTCAAAGAAAGCAGCTTGCGTTGACAGCCTGGGGGCAGCAAGGATGCAGTCTCCCAGGAGAGGATGCACTCGGTGGTGGGAAGCCA GGCTGGAGGGGCCTGAGTGACCCTCTCCACAGGCGGGCAGGGCAGTGGGAGAGGTGGTGTGTGGATACCTCTGTCTCACGCCCAGGGATCAGC AGCATGAACCAGCTTGGGGGGCTCTTTGTGAATGGCCGGCCCCTGCCTCTGGATACCCGGCAGCAGATTGTGCGGCTAGCAGTCAGTGGAATGC GGCCCTGTGACATCTCACGGATCCTTAAGGTAATGGGCCAGCACCTTTACCCAGTGATGGGGACAGGAAGCAGGGAGAAAGGGCTCCTCTGAAG GCAAGAGCCTGGGGCTGTTGCAGGCTCTGAGGGCTTCTGGGACTTGGGTCACTTCCTGGGAGATCCTCTCGGAGGTTGAAAAGGGGAGCCTCAG GCCCTCAAAGGTGAGGCTGGACTCCCGACTTCATGGCCTGGTCCAGTAAGTCTTGGCTTTGTCTTATAGCCTCCTCCTGTCCCAGGGACACTCTCCT TCCTTCTGCCCATCATGCCTCACCTGTCCCTGCTT NM_ Nkx2.2 TCCCCTCCTCCTCCCCACCCCCACCTTTTTTAAGATGCAATTTGTTAAAACGGCCCTTTCAAGTGTGTGGACTCGCGAGCGACGCGGTGGCCCTTTGT ATGTAAATACTGGGTTTAAAAAAAAAAAGGCTCGCCCCGTCTTTGCAATTAATTGACACGTTACACCTCTCATCTTGCTCTAGAGGGCCGTTGGCTG GGAGCGCGGAGCTCCCCAAAACCCACAATTTCACATCTGCAAATACTGTCTTCATCCACTTGACTCCCAAGACCCGCCCACACGTGGCCAACCTTTG CGTTTTTAATGTCTCTTCCCCCTTTTTTCCACCCTTCTCCCGCTCCCTCTCTCGCTCCCCCTCCCTCCCTCTTTCTTTCCCTCCCTCCCTCTCTTTCTCCCCC TCTCCCCGCCTCCCCAGGTTCGTGAGTGGAGCCCAGCCTTATATGGACTGATCGCTCGGGCAATGGCCCATTTTTTCCTCGCCACCAGCCGCCACCG CGCGCCGAGCGGCCGCCGGAGCCCGAGCTGACGCCGCCTTGGCACCCCTCCTGGAGTTAGAAACTAAGGCCGGGGCCCGCGGCGCTCGGCGCGC AGGCCGCCCGGCTT NM_ Foxa2 CGAAGCTCCGTGTCTGCCATCTCGCCTGTCTTCTGCCACCATCGCCCCCAATTTTGGACAGGTGGGCTGGATGCCCACTAGTTCCTATGCATTCTCTG TGTCTGAGGGGGTGGGTACAGGGCTGGATCCCCAAGGTCCAGCCAGGTTTTCAGAACCAAGAAAGAGCCTCCACATCCAAACACCTGCAATATCC CCCCACTCCAAATCTGGGCTCACAGGCTAACCCAGAACAGAAGACAATTTTTGAACCCAAGAGCTGCTGGGGAAATAAAAGTATACGATTGCTGG AGTTTCTAATTTCTATTAAGCAGTCCCTCTGGAAGACAGAGAGGACAGAGACGCTCTTGAAGTCAACTCCATATGCCCCATCATTGATTCCTGGATT CTTCTCTCCTCACCCCTCCCTCCCCACCTCCTGCCCTGTTTGTTTTAGTTACGAAATGCTGTGGGCACCTCGGTTGTGACTGAAAAGTAACCTTGAAA CACGCCGGCCTGAATATCAGAGACAAATCTCAGCCTCCCAACCGTCGGCCGCTGCTAGAGGGGCTGCTTGCGCCAGGCGCCGGCCGCCCCACTGC GGGTCCCTGGCGGCCGGTGTCT NM_

Взаимодействие пептидов с ДНК Пептид Lys-Glu-Asp-Trp Пептид Ala-Glu-Asp-Leu Фрагмент В-ДНК (5-ATATGGCAGGGGTAA-33'- TATACCGTCCCCATT-5) получен из Protein Data Bank PDB code 2KV6 (SOLUTION NMR). Ebond = kcal/mol

Pdx1 связывается с ДНК по большой бороздке 2.4 resolution crystal structure of the Pdx1 bound to a target DNA (PDB: 2H1K, Method: x-ray diffraction)..nlterhikiwfqnrrmkwkkeed

Заключение Экспериментальные данные, полученные методами иммуноцитохимического анализа и ПЦР, позволили выявить стимулирующее действие пептида Lys-Glu- Asp-Trp на факторы дифференцировки клеток поджелудочной железы Методами молекулярного моделирования рассчитан комплекс ДНК-пептид в предполагаемом сайте связывания

Спасибо за внимание!