ПЕРВЫЙ ОПЫТ УЧАСТИЯ В ШТРИХ-КОДИРОВАНИИ ВИДОВ РЫБ РОССИИ НА ОСНОВЕ ПЕРВИЧНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ГЕНА СО-1 Картавцев Ю.Ф., Шарина С.Н., Чичвархин А.Ю., Соколовский А.С., Баланов А.А., Винников К.А., Иванков В.Н. Институт биологии моря имени А.В. Жирмунского Дальневосточного отделения Российской академии наук, Владивосток ;

Схема работы: Отлов рыб Запись в базу данных Определение видов Взятие образцов скелетных мышц, Фиксация в спирте Фотографирование видов рыб Выделение ДНК Амплификация Электрофорез Цикло- секвенирование Извлечение дополнительных последовательностей из GenBank Выравнивание Последовательностей, Удаление гэпов Регистрация своих последовательностей В GenBank Построение филогенетических деревьев Редактирование полученных последовательностей Секвенирование

Некоторые из объектов Рис. 1 Внешний вид (А) полосатой камбалы (Liopseta pinifasciata) и (Б) темной камбалы (Pseudopleuronectes obcurus)

Фрагмент таблицы базы данных (в таблице указывается номер пробы (образца), название вида, систематика вида, кем данный вид определен, где собран, кем и когда).

Тотальную ДНК выделяли из скелетных мышц обычной хлороформ-фенольной методикой с осаждением ДНК спиртом. Полученную ДНК амплифицировали с помощью ПЦР-методики в прямом и обратном направлении с использованием праймеров F1 – R1 и F2 – R2, затем продукты ПЦР подвергали электрофорезу в 1% агарозном геле и окрашивали бромистым этидием после чего просматривали в УФ-свете, где было видно что длина амплифицированной последовательности (т.е. длина гена СО-1) составляет примерно 700п.н. (для определения длины гена использовали маркер ( )).

Праймеры используемые для ПЦР- реакции (Ward et al., 2005) FishF1- 50TCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC30, FishF2- 50TCGACTAATCATAAAGATATCGGCAC30, FishR1- 50TAGACTTCTGGGTGGCCAAAGAATCA30, FishR2- 50ACTTCAGGGTGACCGAAGAATCAGAA30.

Вид продуктов ПЦР-реакции в агарозном геле после электрофореза. Цифрами 2-23 обозначены номера проб, 1 – маркер, стрелкой обозначен старт электрофореза

Амплификация Реакционная смесь на одну пробу (25µl) для ПЦР включала: дистиллированная вода - 17,4 µl; Ex- Tag буфер – 2,5; смесь dNTP – 2,0; праймер F1 (20pmol/ µl ) – 1,0; праймер R1 (20pmol/ µl ) – 1,0; Ex-Tag полимераза – 0,5; образец ДНК – 1,0 30 циклов Температура, ˚C 94,0 60,072,0 4,0 Время, мин 5:000:30 1:007:00 Циклосеквенирование Циклосеквенирование проводили с использованием реагентов фирмы Amersham (Amersham, DYEnamic ET Terminator Cycle Sequencing Kit) 30 циклов Температура, ˚C 95,050,060,04,0 Время, мин 0:200:151:00

Такой вид имеет последовательность после секвенирования, использовалась модель секвенатора АBI-3100 (Applied Biosistems, USA)

Отредактированная последовательность одного образца.

Окно GenBank

Рис. 8 Окна установления параметров для выравнивания (А) штрафы для первого выравнивания, (Б) штрафы для второго выравнивания БА

Выровненные последовательности гена Со-1 взятые из Генного банка вместе со своими последовательностями

Значения средних р-расстояний по гену Со-1 на четырех различных филогенетических уровнях (средняя+SE) : 1. Внутривидовом % 2. Внутриродовом % 3. Внутрисемейственном % 4. Внутриотрядном %

Укорененное дерево построенное на основе метода ближайшего соседства (NJ) показывающее филогенетические взаимосвязи на основе нуклеотидных последовательностей гена Co-1 для 19 проанализированных видов камбал (Pleuronectiformes) и двух внешних таксонов (out-group). В узлах показана bootstrap поддержка n=1000. Древо построено на основе модели Kumara 2 parametres и укорененное по двум внешним таксонам: Окунеообразные (Perciformes). Отрезки снизу показывают масштаб для длин ветвей.

Укорененное Байесовское консенсусное (50%) древо показывающее филогенетические взаимосвязи на основе нуклеотидных последовательностей гена Co-1 для 13 проанализированных видов камбал (Pleuronectiformes) и двух внешних таксонов (out-group). В узлах показаны частоты (вероятности) в n=10 6 модельных повторностей. Древо построено на основе модели Тамуры-Нея (TrN+I+G) и укорененное по двум внешним таксонам: Окунеообразные, Perciformes. Отрезки снизу показывают масштаб для длин ветвей.

Полученные нуклеотидные последовательности были зарегистрированы в GenBank под номерами: EF K-F2 - Liopseta pinifasciata EF K-F1 - Liopseta pinifasciata EF R1 - Liopseta pinifasciata EF K-F1 - Hippoglossoides dubius EF K-F1 - Pseudopleuronectes hersensteini

LOCUS bankit bp DNA circular 01-JUN-2007 DEFINITION Flounder mtDNA Co-1 sequence, coding for cytocrome oxidase subunit 1. ACCESSION VERSION KEYWORDS. SOURCE mitochondrion Pseudopleuronectes hersensteini (Jordan & Snyder, 1901) ORGANISM Pseudopleuronectes hersensteini (Jordan & Snyder, 1901) Unclassified. REFERENCE 1 (bases 1 to 613) AUTHORS Scharina,S., Kartavtsev,Y., Goto,T., Chichvarkhin,A., Hanzawa,N., Sokolovsky,A., Balanov,A., Vinnikov,K. and Ivankov,V. TITLE BARCODING OF FAR EASTERN FLATFISH SPECIES OF RUSSIA ON CYTOCHROME OXIDASE 1 AND CYTOCHROME B GENE SEQUENCE DATA JOURNAL Unpublished REFERENCE 2 (bases 1 to 613) AUTHORS Kartavtsev,Y., Scharina,S., Goto,T. and Chichvarkhin,A. TITLE Direct Submission JOURNAL Submitted (01-JUN-2007) Group of Genetic Resources, Institute of Marine Biology, Paltchevski 17, Vladivostok, Primorye , Russia COMMENT Bankit Comment: Peter the Great Bay, East Sea, August, 2006 FEATURES Location/Qualifiers source /organism="Pseudopleuronectes hersensteini (Jordan & Snyder, 1901)" /organelle="mitochondrion" /mol_type="genomic DNA" /PCR_primers="fwd_name: FishF1, fwd_seq: tcaaccaaccacaaagacattggcac, rev_name: FishR1, rev_seq: tagacttctgggtggccaaagaatca" /genotype="7K-F1" /note="Pisces, Pleuronectiformes, Pleuronectidae, Pseudopleuronectes hersensteini" gene /gene="CO-1" CDS /gene="CO-1" /codon_start=1 /transl_table=2 /protein_id="PROT_1_bankit916597" /translation="MSLGTGLSLLIRAELSQPGALLGDDQIYNVIVTAHAFVMISL** YQLWLEGSETDYPLMIGAPEYGLPSNKNMSFWLLPPSFLLLLASSGWSRGGN*WTVTP H*LELAHAGAS*THHFSLHLAGISQF*GQSTLSPHMNETNSSTMYQIPYLFGPYNYRC PSSPFPPVLAAGITCYWQTAT*TQPSLTLR*GWPILYLLG" BASE COUNT 147 a 172 c 124 g 170 t ORIGIN 1 tgttgtttgt gtgagcctgg ggacaggcct aagtctgctc attcgagcag agctaagcca 61 acctggggct ctcctgggag acgaccaaat ttataacgta atcgtcaccg cacacgcctt 121 tgtaataatt tctttatagt aataccaatt atgattggag ggttcggaaa ctgactatcc 181 attaataatt ggggcccccg aatatggcct tccctcgaat aaaaacatga gcttctgact 241 tctaccccca tccttcctcc ttcttttggc ctcttcaggg tgaagccggg gcgggaacag 301 gtgaaccgtt accccccact agctggaact agcacacgcc ggagcatcgt agactcacca 361 tttctctctt caccttgccg gaatttctca attctagggg caatcaactt tatcaccaca 421 tataaatgaa accaacagca gtactatgta ccaaatcccc tatttgtttg ggccgtataa 481 ttaccgctgt ccttcttctc ctttccctcc ggttctagcc gctggcatta catgctactg 541 acagaccgca acctaaacac aaccttcttt gaccctgcgg agggggtgac ccattcttta 601 cctgttgggt taa Так выглядит запись одной из последовательностей в GenBank:

СПАСИБО ЗА ВНИМАНИЕ!