REACŢIILE IMUNOLOGICE. REACŢIILE AG-AC in vitro. Studiul şi aprecierea imunităţii poate fi efectuată prin intermediul diferitor teste realizate in vitro. - презентация

1 REACŢIILE IMUNOLOGICE. REACŢIILE AG-AC in vitro

2 Studiul şi aprecierea imunităţii poate fi efectuată prin intermediul diferitor teste realizate in vitro sau in vivo (reacţii imunologice). Studiul şi aprecierea imunităţii poate fi efectuată prin intermediul diferitor teste realizate in vitro sau in vivo (reacţii imunologice). Pentru aprecierea răspunsului imun umoral se studiază interacţiunea dintre Ag şi Ac, iar pentru aprecierea imunităţii celulare se determină numărul total de limfocite, subclasele limfocitelor T, se evaluează citokinele, etc. Pentru aprecierea răspunsului imun umoral se studiază interacţiunea dintre Ag şi Ac, iar pentru aprecierea imunităţii celulare se determină numărul total de limfocite, subclasele limfocitelor T, se evaluează citokinele, etc.

3 REACŢIILE ANTIGEN-ANTICORP in vitro (REACŢIILE SEROLOGICE) REACŢIILE ANTIGEN-ANTICORP in vitro (REACŢIILE SEROLOGICE) Reacţia Ag-Ac este determinată de interacţiunea specifică dintre epitopii Antigenului şi paratopii Anticorpilor. În acest proces intervin patru tipuri de legături: legături de hidrogen, legături electrostatice, forţele Van der Waals şi legături hidrofobe. Reacţia Ag-Ac este determinată de interacţiunea specifică dintre epitopii Antigenului şi paratopii Anticorpilor. În acest proces intervin patru tipuri de legături: legături de hidrogen, legături electrostatice, forţele Van der Waals şi legături hidrofobe. Legătura Ag-Ac are trei caracteristici: este exotermică, specifică şi reversibilă. Legătura Ag-Ac are trei caracteristici: este exotermică, specifică şi reversibilă.

4 Afinitatea unui Ac pentru un Ag specific caracterizează intensitatea forţelor de legătură a complexului Ag-Ac. Ea depinde de complementaritatea sterică dintre paratop şi epitop. Afinitatea unui Ac pentru un Ag specific caracterizează intensitatea forţelor de legătură a complexului Ag-Ac. Ea depinde de complementaritatea sterică dintre paratop şi epitop.

5 A viditatea unui Ac pentru un Ag specific reprezintă rapiditatea apariţiei manifestării reacţiei Ag-Ac (precipitare, aglutinare, etc.). Ea depinde de constanta de asociere, de valenţa Ac, de numărul de epitopi, de temperatură, de pH, de forţa ionică a mediului. A viditatea unui Ac pentru un Ag specific reprezintă rapiditatea apariţiei manifestării reacţiei Ag-Ac (precipitare, aglutinare, etc.). Ea depinde de constanta de asociere, de valenţa Ac, de numărul de epitopi, de temperatură, de pH, de forţa ionică a mediului. Un paratop se poate combina cu un singur epitop, numit specific. Astfel, dacă este cunoscut unul din elementele reacţiei - Ag sau Ac, poate fi identificat celălalt Un paratop se poate combina cu un singur epitop, numit specific. Astfel, dacă este cunoscut unul din elementele reacţiei - Ag sau Ac, poate fi identificat celălalt

6 Reacţiile Ac-Ac (reacţiile serologice) au două direcţii de aplicare practică: Reacţiile Ac-Ac (reacţiile serologice) au două direcţii de aplicare practică: I.Seroidentificare: Detectarea şi dozarea Ag (element necunoscut - tulpini microbiene izolate din diferite prelevate) cu ajutorul Ac specifici cunoscuţi. Pot fi utilizate două surse de Ac: Ac monoclonali, absolut omogeni, dar care recunosc doar un singur epitop şi Ac policlonali, ce se conţin în seruri imune (antiseruri), care permit legături de aviditate înaltă cu Ag.

7 Serurile imune se obţin prin injectarea la un animal de laborator a antigenelor cunoscute. După o perioadă de timp, serul animalului va conţine anticorpi contra acestor antigene. Dar natura exactă a Ac din acest ser nu poate fi cunoscută cu exactitate (Ac policlonali). Specificitatea serului trebuie să fie permanent controlată şi Ac nedoriţi trebuie să fie eliminaţi prin adsorbţie.

8 II. Serodiagnostic: Detectarea şi titrarea Ac din serul bolnavilor (component necunoscut) faţă de un Ag specific cunoscut (conţinut în diagnosticuri). Unele reacţii Ag-Ac se manifestă direct şi pot fi observate de experimentator: de exemplu precipitarea sau aglutinarea complexelor Ag-Ac, liza unor celule purtătoare de Ag pe membrana lor (hemoliză, bacterioliză, etc).

9 Alte reacţii Ag-Ac nu se vizualizează spontan in vitro. În acest caz se va recurge la nişte artificii experimentale, cum ar fi utilizarea Ac marcaţi: Alte reacţii Ag-Ac nu se vizualizează spontan in vitro. În acest caz se va recurge la nişte artificii experimentale, cum ar fi utilizarea Ac marcaţi: Ac marcaţi cu un fluorocrom: imunofluorescenţa. Ac marcaţi cu un fluorocrom: imunofluorescenţa. Ac marcaţi cu un izotop radioactiv: analiza radio-imună. Ac marcaţi cu un izotop radioactiv: analiza radio-imună. Ac marcaţi cu o enzimă: analiza imunoenzimatică. Ac marcaţi cu o enzimă: analiza imunoenzimatică.

10 INTERACŢIUNEA ANTIGEN-ANTICORP I. Faza specifică: are loc interacţiunea dintre Ag şi Ac specific corespunzător. Este un fenomen rapid, invizibil, comun pentru toate reacţiile Ag-Ac. Decurge la temperatura de 37 C, în prezenţa unui electrolit (sol. fiziologică). II. Faza nespecifică, vizibilă a uniunii Ag-Ac, se manifestă prin precipitare, aglutinare, liză, etc - fenomene determinate de anumite condiţii (valenţa Ac, dimensiunile Ag, etc).

11 REACŢIA DE AGLUTINARE Din latină – agglutinatio - încleiere Reacţia Ag-Ac se poate manifesta prin aglutinare atunci când determinantele antigenice sunt purtate de particule figurate (Ag insolubile, corpusculare), iar Ac specifici sunt compleţi (cel puţin bivalenţi). Reacţia Ag-Ac se poate manifesta prin aglutinare atunci când determinantele antigenice sunt purtate de particule figurate (Ag insolubile, corpusculare), iar Ac specifici sunt compleţi (cel puţin bivalenţi). Aglutinarea este determinată de formarea unei reţele între Ag şi Ac, ce permite apropierea unui număr suficient de particule figurate pentru a constitui aglutinate vizibile cu ochiul liber. Ac IgM cu 10 epitopi potenţiali aglutinează mai activ decât Ac IgG. Aglutinarea este determinată de formarea unei reţele între Ag şi Ac, ce permite apropierea unui număr suficient de particule figurate pentru a constitui aglutinate vizibile cu ochiul liber. Ac IgM cu 10 epitopi potenţiali aglutinează mai activ decât Ac IgG.

12

13 Clasificarea reacţiilor de aglutinare Clasificarea reacţiilor de aglutinare 1. Aglutinare activă sau directă, în care particula figurată (Ag corpuscular) este el însuşi purtător de determinante antigenice specifice (hematii, leucocite, trombocite, spermatozoizi, bacterii) 2. Aglutinare pasivă sau indirectă, în care particula serveşte doar de suport pentru un determinant antigenic solubil fixat artificial pe suprafaţa sa. Frecvent sunt utilizate ca suport hematii formolate, particule de latex sau microcristale de colesterol.

14

15 Reactii de aglutinare activa (directa) Reactii de aglutinare activa (directa) Aspect calitativ Aspect calitativ Reactia poate fi efectuata pe lama de sticla sau in tuburi. Reactia pe lama Se amesteca o picatura de ser si o picatura de suspensie bacteriana (Ag). Lectura se face la microscop sau cu ochiul liber. In caz de reactie pozitiva apar conglomerate, iar lichidul se clarifica; in caz de reactie negativa, lichidul ramane tulbure. lichidul ramane tulbure.

16

17

18 Reactia in tuburi In eprubeta se amesteca serul si Ag figurate (hematii, bacterii). Reactia pozitiva se manifesta prin formarea unui sediment cu aspect de umbrela inversata la fundul tuburilor (peste ore) şi clarificarea lichidului. Aprecierea intensitaţii reacţiei se efectueaza dupa sistema de 4 plusuri (++++). Celulele neaglutinate se sedimenteaza la fundul tuburilor sub forma de buton sau inel (reactie negativa). Lectura se face cu ochiul liber sau folosind oglinda concava a microscopului.

19 Aspect cantitativ Aspect cantitativ Metoda dilutiilor succesive Initial se efectueaza dilutii succesive ale serului (1/50, 1/100, 1/200, etc) in care se introduc ulterior cantitati egale de Ag. Termostat – 2 ore, apoi la t camerei ore. Aprecierea: cea mai mare dilutie a serului in care se manifesta aglutinare de cel putin 3 + (+++) se numeste titrul anticorpilor aglutinanti (titrul serului aglutinant). Aglutinarea directa este utilizata pentru determinarea grupelor sangvine sau in diagnosticul unor maladii infectioase (seroidentificarea Ag sau depistarea şi titrarea Ac din serul bolnavilor). Aglutinarea directa este utilizata pentru determinarea grupelor sangvine sau in diagnosticul unor maladii infectioase (seroidentificarea Ag sau depistarea şi titrarea Ac din serul bolnavilor).

20

21 Reactile de aglutinare pasiva (indirecta) Reactile de aglutinare pasiva (indirecta) Aglutinarea pasiva consta in fixarea unui Ag solubil (sau al unui Ac) pe un suport corpuscular inert, care nu intervine in reactia Ag-Ac. In calitate de suport inert pot servi hematiile, particule de latex, cristale de colesterol. Suspensia de particule sensibilizate cu Ag sau Ac este pusa in contact cu serul imun (respectiv cu Ag), ca si in cazul aglutinarii directe. Aglutinarea pasiva consta in fixarea unui Ag solubil (sau al unui Ac) pe un suport corpuscular inert, care nu intervine in reactia Ag-Ac. In calitate de suport inert pot servi hematiile, particule de latex, cristale de colesterol. Suspensia de particule sensibilizate cu Ag sau Ac este pusa in contact cu serul imun (respectiv cu Ag), ca si in cazul aglutinarii directe. Avantajele reactiilor indirecte: facilitatea lecturii si sensibilitatea inalta. Avantajele reactiilor indirecte: facilitatea lecturii si sensibilitatea inalta.

22 Reactia de hemaglutinare indirecta (pasiva) – RHAI / RHAP Reactia de hemaglutinare indirecta (pasiva) – RHAI / RHAP Unele antigene de origine polizaharidica se fixeaza practic spontan, dupa o scurta incubatie, pe suprafata hematiilor. Antigenele proteice se fixeaza doar dupa o pregatire prealabila a hematiilor (de ex.: tratarea cu tanina, formol). Unele antigene de origine polizaharidica se fixeaza practic spontan, dupa o scurta incubatie, pe suprafata hematiilor. Antigenele proteice se fixeaza doar dupa o pregatire prealabila a hematiilor (de ex.: tratarea cu tanina, formol). RHAI se efectuează in godeurile unei placi din polistiren. Reactia pozitiva se manifesta prin aglutinarea eritrocitelor sensibilizate (umbrela inversata de culoare bruna la fundul godeurilor). RHAI se efectuează in godeurile unei placi din polistiren. Reactia pozitiva se manifesta prin aglutinarea eritrocitelor sensibilizate (umbrela inversata de culoare bruna la fundul godeurilor).

23

24 În reacţia de latex-aglutinare Ac sau Ag sunt fixaţi pe particule de latex. Reacţia se efectuează pe lama de sticlă. În reacţia de latex-aglutinare Ac sau Ag sunt fixaţi pe particule de latex. Reacţia se efectuează pe lama de sticlă.

25 Reacţia de latex-aglutinare este utilizata in identificarea factorului reumatoid la bolnavi suspecti de poliartrita reumatoida, in bacteriologie pentru identificarea rapidă a mi/o sau Ag lor în prelevate, sau identificarea tulpinilor izolate, de asemenea pentru serodiagnosticul unor infecţii. Reacţia de latex-aglutinare este utilizata in identificarea factorului reumatoid la bolnavi suspecti de poliartrita reumatoida, in bacteriologie pentru identificarea rapidă a mi/o sau Ag lor în prelevate, sau identificarea tulpinilor izolate, de asemenea pentru serodiagnosticul unor infecţii.

26 Reacţia de Co-aglutinare. Reacţia de Co-aglutinare. La baza acestei reacţii se află proprietatea unei bacterii – Staphylococcus aureus (tulpina Cowan) - ce are în componenţa peretelui celular proteina A - să fixeze Ig G prin intermediul fragmentului Fc. Astfel se formează diagnosticuri cu Ac, cu ajutorul carora pot fi identificare Ag respective necunoscute. Reacţia se efectuează pe lamă.

27

28 REACŢIA COOMBS REACŢIA COOMBS Unii Ac (monovalenţi) nu sunt aglutinanţi în condiţii normale, fiind monovalenti (ex.: anticorpii anti-Rh, responsabili de incompatibilitatea materno-fetală în sistemul Rh). Ei pot fi depistaţi graţie testelor Coombs. Sunt posibile 2 tehnici, în funcţie de prelevat: sânge de la nou-născut sau de la femeia gravidă.

29

30 - Tehnica Coombs directă. La un nou- născut se caută prezenţa Ac materni anti- Rh fixaţi pe hematii, dacă mama este Rh-. La aceste hematii suspecte se adaugă un ser anti-Ig umană. Acest ser nu aglutinează hematiile normale, din contra, el provoacă aglutinarea hematiilor pe care sunt fixaţi Ac anti-Rh.

31 - Tehnica Coombs indirectă. La o femeie gravidă Rh- Ac anti-Rh sunt prezenţi în ser. Iniţial la acest ser se agaugă hematii Rh+ (pentru formarea complexului Ag- Ac), apoi se aplică serul anti-Ig.

32

33 REACTIILE DE PRECIPITARE REACTIILE DE PRECIPITARE Imunoprecipitarea se manifesta doar atunci cand Ag solubil este amestecat cu Ac corespunzator. Ea poate fi observata sau in mediu lichid, sau solid, fiind sau calitativa, sau cantitativa. Acestea sunt reactii specifice dar putin sensibile, ce necesita cantitati importante de anticorpi. Imunoprecipitarea se manifesta doar atunci cand Ag solubil este amestecat cu Ac corespunzator. Ea poate fi observata sau in mediu lichid, sau solid, fiind sau calitativa, sau cantitativa. Acestea sunt reactii specifice dar putin sensibile, ce necesita cantitati importante de anticorpi. Precipitarea complexelor moleculare rezultate din uniunea Ag-Ac este determinata de formarea unei retele tridimensionale de Ag reunite prin Ac. Precipitarea complexelor moleculare rezultate din uniunea Ag-Ac este determinata de formarea unei retele tridimensionale de Ag reunite prin Ac.

34 Condiţiile de formare a reţelei de precipitare: Ac sa fie cel putin bivalent (Ac completi) Ac sa fie cel putin bivalent (Ac completi) Ag sa fie multivalent (haptenele nu pot fi precipitate) Ag sa fie multivalent (haptenele nu pot fi precipitate) Precipitarea maxima corespunde cu zona de echivalenţă, unde Ac si Ag sunt in raport optimal de concentraţie, ce permite precipitarea tuturor moleculelor de Ac cu Ag corespunzator. În exces de Ag sau de Ac precipitatul nu se formează. Precipitarea maxima corespunde cu zona de echivalenţă, unde Ac si Ag sunt in raport optimal de concentraţie, ce permite precipitarea tuturor moleculelor de Ac cu Ag corespunzator. În exces de Ag sau de Ac precipitatul nu se formează. Utilizare: în medicina legala (determinarea apartenenţei de specie a diferitor proteine: sânge, spermă, etc), în igiena alimentară (depistarea falsificării alimentelor), în diagnosticul maladiilor infectioase, etc Utilizare: în medicina legala (determinarea apartenenţei de specie a diferitor proteine: sânge, spermă, etc), în igiena alimentară (depistarea falsificării alimentelor), în diagnosticul maladiilor infectioase, etc

35

36 PRECIPITAREA IN MEDIU LICHID Reactia de precipitare inelara Reactia de precipitare inelara Intr-un tub cu diametrul de cinci millimetri se introduce serul imun; pipeta se inclina si pe peretii ei se lasa sa se prelinga incet solutia de Ag, ca sa nu se amestece cu serul. Daca Ac din ser corespund cu Ag, in zona de separare a celor doua lichide se formeaza un inel alb, ceea ce se formeaza un inel alb, ceea ce semnifica precipitarea complexului Ag-Ac. Avantajul metodei – rapiditatea si simplicitatea. si simplicitatea. Utilizarea practica: identificarea petelor de sange, depistarea falsificarilor produselor alimentare, depistarea produselor alimentare, depistarea antigenului polizaharidic al agentului antraxului in omogenat de organe (reactia Ascoli).

37 Reacţia de floculare (tehnica Ramon) Reacţia de floculare (tehnica Ramon) Se efectuează diluţia succesivă a serului imun (Ac) la care se adauga cantităţi egale de Ag. Se întroduc probele în termostat şi periodic se examinează pentru depistarea tubului în care apare precipitatul iniţial (zona de echivalenţă). Utilizare: pentru determinarea cantităţii de toxină, antitoxină sau anatoxină.

38 PRECIPITAREA ÎN MEDIU SOLID (ÎN GEL) PRECIPITAREA ÎN MEDIU SOLID (ÎN GEL) În aceste reacţii Ag şi Ac difuzează unul spre altul prin geloză şi în zona de concentraţie optimă a acestor două reactive se produce precipitarea sub formă de linii albe- cenuşii. Dacă există mai multe sisteme Ag-Ac, se vor forma linii de precipitare distincte. Poate fi utilizată în analiza calitativă a unui amestec de Ag într-o soluţie.

39 Imunodifuzia simplă radială (tehnica Mancini) Imunodifuzia simplă radială (tehnica Mancini) Se efectuează pe o placă acoperită cu geloză, în care sunt încorporaţi Ac specifici. Ag este depus în godeurile din stratul de geloză. Ag difuzează radial în geloză pe parcursul a 48 ore. Dacă Ag corespunde Ac, atunci are loc formarea de discuri de precipitare, cu suprafaţa proporţională concentraţiei Ag din godeu. Se utilizeză pentru depistarea şi cuantificarea Ig, hormonilor, enzimelor, etc.

40

41 Imunodifuzie dublă (tehnicile Ouchterlony şi Elek) Se acoperă cu geloză o placă de sticlă sau se toarnă geloza în cutia Petri. În tehnica Ouchterlony Ag şi Ac difuzează din godeurile situate la o distanţă de 15 mm unul de altul. În tehnica Ouchterlony Ag şi Ac difuzează din godeurile situate la o distanţă de 15 mm unul de altul. În tehnica Elek cele 2 reactive difuzează din benzile de hârtie plasate pe suprafaţa gelozei. În tehnica Elek cele 2 reactive difuzează din benzile de hârtie plasate pe suprafaţa gelozei. Moleculele difuzează în gel în funcţie de greutatea lor şi formează linii de precipitare pentru fiecare sistem Ag-Ac ce corespund în zona lor de echivalenţă. Dacă două Ag sunt identice, liniile lor se unesc, dacă sunt diferite – se intersectează. Utilizarea – determinarea toxinelor (toxigeneza), antitoxinelor, Ag proteice Moleculele difuzează în gel în funcţie de greutatea lor şi formează linii de precipitare pentru fiecare sistem Ag-Ac ce corespund în zona lor de echivalenţă. Dacă două Ag sunt identice, liniile lor se unesc, dacă sunt diferite – se intersectează. Utilizarea – determinarea toxinelor (toxigeneza), antitoxinelor, Ag proteice

42

43

44

45 Contraimunoelectroforeza (CIEF) Contraimunoelectroforeza (CIEF) Este utilă la examinarea amestecurilor antigenice complexe. Lectura este posibila peste 90 minute. Geloza este turnată pe o placă de sticlă, Ag şi Ac sunt dispuşi în rezervoare circulare de 2 mm diametru, la o distanţă de 10 mm. În timpul electroforezei Ag, încărcat negativ, migrează spre polul pozitiv, întâlnind Ac care migrează spre catod. La interacţiunea Ag şi Ac omologi are loc formarea liniei de precipitare. CIEF serveşte la examinarea componentelor Ag din lichide biologice: LCR, urină, lichid pleural, ascită, etc.

46

47

48 REACŢII DE CITOLIZĂ IMUNĂ (cu participarea complementului) REACŢII DE CITOLIZĂ IMUNĂ (cu participarea complementului) Activarea fracţiilor complementului (C) duce la liza particulei purtătoare de Ag (hematii, bacterii, diverse celule...) Activarea fracţiilor complementului (C) duce la liza particulei purtătoare de Ag (hematii, bacterii, diverse celule...) Activarea complementului Activarea complementului - Calea clasică - Calea alternativă - Calea lectinică

49 Activarea C pe cale clasică Activarea C pe cale clasică Activatorul îl constituie complexe Ag-Ac (IgG, IgM) Consecutivitatea activării C: Ag-Ac fixează fracţia C1qrs, care capătă ulterior activitate esterazică (în prezenţa obligatorie a Ca ++ )

50 C1 activează C4, cu formarea complexului AgAcC1C4b. Este apoi activat C2 (AgAcC1C4bC2a), complexul C4bC2a devenind convertază ce acţionează asupra C3

51 Urmează clivarea C3 în C3a (anafilotoxină) şi C3b, care se uneşte de complex (AgAcC1C4bC2aC3b), formând C5-convertaza, care clivează C5 în C5a şi C5b

52 C5b se leagă de membrana celulei-ţintă. Urmează fixarea simultană a C,6,7. La final se fixează C8, apoi C9, formând complexul de atac membranar. Fixarea lor produce leziuni ireversibile – liza celulei.

53 Calea alternativă de activare a C Activatori: endotoxine, celule infectate cu virus, levuri, paraziţi, venin de cobră, agregate de IgA sau IgE. C1,4 şi 2 nu intervin şi reacţia începe cu C3. Properdina, factorul B şi ionii de Mg ++ sunt obligatorii în procesul de activare pe cale alternativă.

54

55 Calea lectinică de activare a C este determinată de legarea unor lectine pe unele grupări de manoză, carbohidrat prezent în componenţa multor mi/o şi absentă la ma/o. Lectina este echivalentă fracţiei C1q. Alte 2 molecule se asociază, formând o enzimă similară C1, ceea ce duce la formarea complexului C4bC2a (C3- convertaza) Calea lectinică de activare a C este determinată de legarea unor lectine pe unele grupări de manoză, carbohidrat prezent în componenţa multor mi/o şi absentă la ma/o. Lectina este echivalentă fracţiei C1q. Alte 2 molecule se asociază, formând o enzimă similară C1, ceea ce duce la formarea complexului C4bC2a (C3- convertaza)

56 Componentele reacţiilor de liză: - Ag (celule bacteriene, hematii, etc) - Ac (lizine - IgG şi IgM) - Complement– ser proaspăt de cobai sau ser de cobai liofilizat Reacţia de bacterioliză (RBL) - Ag – suspensie de bacterii vii (vibrioni, leptospire...) - Ac – serul imun sau serul bolnavului - Complement

57 RBL in vitro RBL in vitro - Se efectuează diluţia succesivă a serului - Se adaugă suspensie microbiană vie - Se adaugă complement (martor: Ag+ser fiziologic+C) - Incubare 2 h la 37°C - Reînsămânţare pe cutii cu geloză câte 0,1 ml din fiecare diluţie (24h – 37° C) - Lectura – se compară nr coloniilor crescute din martor şi probele studiate - Titrul – cea mai mare diluţie a serului în care au fost lizate cel puţin 50% din celule

58 RBL in vivo RBL in vivo - Amestecul dintre Ag şi Ac se inoculează intra-peritoneal la animale de laborator (ex.: şoareci albi) - Peste fiecare 10 min, timp de o oră, se extrage lichidul peritoneal, se pregăteşte un preparat nativ şi se examinează pe fond negru sau cu contrast de fază. - Rezultat pozitiv – numărul bacteriilor scade treptat până la dispariţie. Utilizarea RBL – diagnosticul holerei (RVL), leptospirozelor (RALL)

59 Reacţia de hemoliză (RHL) - Ag – hematii de berbec, suspensie de 3% - Ac – ser imun de iepure anti-hematii de berbec (serul hemolitic) - Complement Principiul reacţiei: complexele Ag-Ac formate fixează C şi-l activează pe cale clasică, provocând hemoliza. Intensitatea hemolizei se apreciază vizual (++++) sau prin măsurarea densităţii optice a hemoglobinei eliberate. Utilizarea practică a RHL: pentru dozarea C, precum şi în montarea reacţiei de fixare a complementului.

60 REACŢIA DE FIXARE A COMPLEMENTULUI (RFC) REACŢIA DE FIXARE A COMPLEMENTULUI (RFC) Este o reacţie complexă, constituită din 2 sisteme Ag-Ac şi cu participarea C. Este o reacţie complexă, constituită din 2 sisteme Ag-Ac şi cu participarea C. În RFC participă Ig capabile să fixeze C – IgM şi IgG. În RFC participă Ig capabile să fixeze C – IgM şi IgG. RFC se utilizează în diagnosticul virozelor, infecţiilor bacteriene, etc RFC se utilizează în diagnosticul virozelor, infecţiilor bacteriene, etc Toate componentele RFC sunt utilizate în acelaşi volum fiind titrate în prealabil pentru aprecierea dozelor de lucru. Toate componentele RFC sunt utilizate în acelaşi volum fiind titrate în prealabil pentru aprecierea dozelor de lucru. Reacţia este însoţită de martori ai tuturor componenţilor Reacţia este însoţită de martori ai tuturor componenţilor

61 Reacţia se efectuează în 2 etape utilizând 2 sisteme. Reacţia se efectuează în 2 etape utilizând 2 sisteme. I etapă – Sistemul de bază este constituit din Ag1 (diagnosticuri sau Ag necunoscute), Ac1 (serul bolnavului sau serul imun) şi complement în doza de lucru. Amestecul este incubat 1h la 37° C sau menţinut ore la 4° C. Dacă Ac se combină cu Ag omolog va avea loc şi fixarea C (efect frecvent invizibil).

62 II etapă – la sistemul de bază se adaugă sistemul indicator (hemolitic), constituit din hematii de berbec (Ag2) combinate cu Ac specifici – serul hemolitic (Ac2). Peste 1h incubare la 37° C reacţia este terminată. Evaluarea rezultatelor – dacă complementul a fost fixat de primul sistem Ag-Ac hemoliza nu se observă (rezultat pozitiv). Dacă Ag1 nu corespunde cu Ac1, complementul rămâne disponibil pentru fixare pe sistemul indicator Ag2-Ac2, provocând hemoliza (rezultat negativ)

63 Complement Fixation Ag Patients serum Ag No Ag Ag

64

65 Tehnici serologice cu utilizarea Ac marcaţi Tehnici serologice cu utilizarea Ac marcaţi În unele cazuri este imposibil de a detecta o reacţie Ag-Ac: unii Ac nu precipitează, alţii nici nu precipitează, nici nu aglutinează, există complexe Ag-Ac care nu fixează C. În aceste cazuri pot fi utilizaţi Ac marcaţi pentru a vizualiza Ag respectiv. Conjugarea Ac cu marcanţi nu afectează proprietăţile lor imunologice. Aceste reacţii se montează pe suport solid (lamă, plăci din plastic)

66 Marcanţii utilizaţi uzual: Marcanţii utilizaţi uzual: - Fluorocromi (rodamina, fluoresceina), care emit respectiv o lumină roşu-oranj sau verde-galbenă la tratarea lor cu raze UV (Reacţia de Imuno- Fluorescenţă) - Enzime (fosfataza alcalină, peroxidaza), capabile să modifice culoarea unui substrat (Reacţia Imuno- enzimatică) - Radio-izotopi ( 125 J sau 3 H), care emit respectiv raze gamma şi beta (Analiza Radio-Imună)

67 Reacţia de imunofluorescenţă (RIF, reacţia COONS) Reacţia de imunofluorescenţă (RIF, reacţia COONS) Metoda directă (numai în scop de seroidentificare). Din materialul ce conţine Ag (material nativ, cultură pură, biopsie tisulară) se prepară un frotiu, peste care se aplică serul imun specific cu Ac marcaţi cu fluorocrom. Peste 20 min de incubare într-o cameră umedă preparatul este studiat la microscopul luminiscent. În caz de reacţie pozitivă se observă luminiscenţă locală. Inconvenient – necesitatea de a avea seruri imune marcate specifice pentru fiecare Ag.

68 positive test for rabies negative test for rabies

69

70 Metoda indirectă. Poate fi utilizată pentru sero-identificare şi sero- diagnostic. Metoda indirectă. Poate fi utilizată pentru sero-identificare şi sero- diagnostic. Pe frotiul ce conţine Ag se aplică Ac corespunzători nemarcaţi. Peste 20 min se spală minuţios preparatul, apoi se adaugă anti-Ig fluorescentă, care se va combina cu Ac din complex. Acest reactiv poate fi utilizat în numeroase reacţii. Anti-Ig se obţine prin imunizarea iepurilor (sau altor animale) cu Ig umane.

71

72 Tehnica fondată pe fixarea C: Markerul fluorescent este un ser anti-complement care se va lega de complementul fixat pe complexul Ag- Ac. Tehnica fondată pe fixarea C: Markerul fluorescent este un ser anti-complement care se va lega de complementul fixat pe complexul Ag- Ac. RIF se utilizează pentru identificarea rapidă a Ag din biosubstrate sau pentru serodiagnostic. RIF se utilizează pentru identificarea rapidă a Ag din biosubstrate sau pentru serodiagnostic.

73 Reacţia Imuno-Enzimatică (RIE, ELISA - Enzyme Linked Immunosorbent Assays). Reacţia Imuno-Enzimatică (RIE, ELISA - Enzyme Linked Immunosorbent Assays). - RIE directă (metoda sandwich). Utilizată doar în sero-identificarea Ag. În godeurile din placa de polistiren în care sunt fixaţi Ac cunoscuţi se toarnă soluţia de Ag necunoscut. Se incubează 1h. După o spălare minuţioasă a godeurilor se adaugă Ac marcaţi cu enzime, care se fixează pe epitopii liberi ai Ag polivalent. După incubare de 30 min-1h se spală iarăşi godeurile. Prezenţa complexului Ac- Ag-Ac-marcat se depistează cu ajutorul substratului cromogen (substanţă iniţial incoloră, dar care se colorează sub acţiunea enzimei, ex. apa oxigenata si orthofenilendiamina).

74

75 - RIE indirectă. Utilizată în serodiagnostic. Ag cunoscut este fixat la fundul godeurilor. Ac (serul testat) se întroduce în godeu, după 1h se spală totul şi se adaugă ligandul marcat cu enzimă (anti-Ig sau proteina A cuplate cu enzimă). Acest ligand se fixează pe Ac testaţi. Se adaugă apoi substratul cromogen. Cantitatea de Ac se măsoară după densitatea optică a lichidului din godeuri.

76

77

78 - Tehnica imunoblot (western blot) permite identificarea Ag sau ai Ac dintr-un amestec. I etapă – electroforeza în gel a probei de Ag II etapă – transferul electric al Ag pe membrana de nitroceluloză III etapă – pe membrană sunt aplicaţi succesiv Ac dirijaţi contra Ag, apoi conjugatul marcat cu enzimă, care permite depistarea Ac fixaţi. După o spălare se adaugă substratul cromogen. Fiecare complex Ag-Ac formează zone colorate distincte. Utilizare: depistarea Ac anti-HIV, caracterizarea Ac monoclonali...

79

80 Proteinele sunt separate electroforetic în gel poliacrilamid. Sub acţiunea câmpului electric are loc difuzia proteinelor conform greutăţii moleculare, aranjându-se în zone liniare subţiri diferite: mai aproape de start se aranjează proteinele cu masă moleculară mare ( kDa), la final se aranjează proteinele cu masă moleculară mică (5- 10kDa). Proteinele sunt separate electroforetic în gel poliacrilamid. Sub acţiunea câmpului electric are loc difuzia proteinelor conform greutăţii moleculare, aranjându-se în zone liniare subţiri diferite: mai aproape de start se aranjează proteinele cu masă moleculară mare ( kDa), la final se aranjează proteinele cu masă moleculară mică (5- 10kDa). Apoi lamela de gel este transferată pe o foaie de nitroceluloză amplasată între electrozii unei surse de curent continuu. Sub acţiunea câmpului electric are loc trecerea proteinelor din gel pe nitroceluloză, unde se fixează foarte bine pe hârtie. Apoi lamela de gel este transferată pe o foaie de nitroceluloză amplasată între electrozii unei surse de curent continuu. Sub acţiunea câmpului electric are loc trecerea proteinelor din gel pe nitroceluloză, unde se fixează foarte bine pe hârtie. Proteinele fixate sunt marcate cu o enzimă (e.g. alkaline phosphatase sau peroxidase) incoloră. Proteinele fixate sunt marcate cu o enzimă (e.g. alkaline phosphatase sau peroxidase) incoloră. Procedura ulterioară de montare a reacţiei este similară tehnicii ELISA. Procedura ulterioară de montare a reacţiei este similară tehnicii ELISA.

81

82 Analiza radioimună (ARI) Analiza radioimună (ARI) Principiul este identic cu cel al RIE Ag se fixează la fundul godeurilor din placa de plastic. Se adaugă Ac testaţi care se vor combina cu Ag omolog. După spălarea godeurilor, se adaugă un ligand radiomarcat (anti-Ig). După eliminarea excesului de izotopi prin spălare, se măsoară radio- activitatea: ea este proporţională cu concentraţia Ac dozaţi.

83

84 Reacţia de neutralizare (RN): formarea complexelor Ag-Ac duce la neutralizarea efectului biologic al Ag (neutralizarea toxinelor, enzimelor, virusurilor). Reacţia de neutralizare (RN): formarea complexelor Ag-Ac duce la neutralizarea efectului biologic al Ag (neutralizarea toxinelor, enzimelor, virusurilor). Reacţia de imobilizare Reacţia de imobilizare Unii anticorpi anti-bacterieni pot provoca imobilizarea bacteriilor mobile (vibrioni, spirochete)