Engineered PNA-acridone conjugates interact with human telomeric DNA: a hybrid PNA 1 -DNA 1 quadruplex assembly. Supramolecular Systems in Chemistry and. - презентация

1 Engineered PNA-acridone conjugates interact with human telomeric DNA: a hybrid PNA 1 -DNA 1 quadruplex assembly. Supramolecular Systems in Chemistry and Biology Tuapse 2008 I nstitut de S cience et d I ngénierie S upramoléculaires (ISIS) Université Louis Pasteur, UMR 7006 Laboratoire de Chimie et Reconnaissance de Biomolécules 8 allée Gaspard Monge, Strasbourg cedex

2 G : C A : T Watson-Crick Guanine tetrad (Hoogsteen type bondings) Guanine quadruplex (G4) DNA

3 Intramolecular quadruplex (Forms at the end of the telomeres for instance) THERAPEUTIC TARGET Ligands that stabilise or induce the formation of quadruplexes at the end of telomeres show potent anticancer activity

4 Extract from Luu KN, Phan AT, Kuryavyi V, Lacroix L, Patel DJ. JACS 2006, 128(30), pp Quadruplex formed by telomeric human DNA d(TTAGGG) n Highly polymorphic = difficulty to elaborate some specific ligands d(GGGTTA) 3 can also form stable bimolecular quadruplex As evidenced by NMR d(GGGTTA) 4 can fold in at least 3 conformations characterised by NMR or X-ray

5 Hybrid bimolecular quadruplexes formation PNA/DNA = new way of targeting human telomeric DNA Supramolecular (en)vision with biological applications Engineered PNA-acridone conjugates =

6 Peptide Nucleic Acids (PNA) = Peptidic DNA analogues Duplex Stability : PNA:PNA > PNA:DNA > DNA:DNA

7 Hybrid bimolecular DNA/PNA quadruplexes formation Hydrosoluble PNA sequence Lys-G-G-G-Gly-Acridone + fragment of telomeric DNA d(GGGTTAGGGTTAGGG) OBJECTIVES: - New « supramolecular » system - Our goal: possibility to « induce » into genome artificial quadruplexes formation in presence of our PNA and d(GGGN1GGGN2GGG) DNA sequences type (New therapeutic targets)

8 G tetrad ligand Spacer G required for tetrads formation Water solubility

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10 … Synthesis of PNA using Fmoc chemistry [M+H] + [M+2H] 2+

11 SPECTROSCOPIC STUDIES OF THE PNA/DNA INTERACTION Mass spectrometry (Complex Stoichiometry) U.V. (Melting T measurement) C.D. (G4 structural informations)

12 Mass spectrometry (Nano-ESI) Formation of PNA/DNA 1:1 complex Stoichiometric mixture DNA/PNA preformed in NH 4 Ac buffer(50 mM) However : quadruplex structure type ? formation of hybrid tetrads PNA/DNA?

13 UV Spectrometry 295 nm Melting curves Experimental conditions : Stoichiometric mixture DNA d(G 3 TTAG 3 TTAG 3 ) + PNA 1 (20 µM each) Solubilized in various buffers: (different salt content) potassium phosphate 100 mM mM KCl (pH 7.4) potassium phosphate 100 mM (pH 7.4) water (pH 7.4)

14 23.0G3 + PNA 1 > + 13 < 10G3 H 2 0 pH G3 + PNA G3 100 mM KH 2 PO 4 pH G3 + PNA G3 100 mM KH 2 PO 4 pH mM KCl ΔTm (°C) [a] Tm (°C)complexBuffer composition DNA quadruplex stability strongly depending on KCl concentration PNA-DNA hybrid quadruplex stability less strongly dependent, suggesting PNA guanines participation into PNA/DNA hybrid tetrads

15 G3 forms a hybrid quadruplex parallel (260)/antiparallel (295) Strongly depending on salt concentration (no G4 in H 2 O) Circular dichroïsm DNA and DNA:PNA Complexes conformation (G3 + PNA) forms a quadruplex « mainly parallel » Less depending on salt concentration (also formed in water)

16 « Normal » quadruplex DNA : Stability strongly dependant on salt concentration (only forms if monovalent cations are present) « Synthetic » quadruplex PNA 4 : Stability doesnt depend on salt concentration (and can even form in the absence of cations) « Hybrid » complex PNA 1: DNA G3 : Stability influenced by the amount of cations but Influence less important than observed for pure DNA quadruplex Formation of hybrid PNA:DNA bimolecular quadruplex with a 1:1 stoichiometry Involving formation of PNA:DNA « hybrid tetrads » CONCLUSION A. Paul, P. Sengupta, Y. Krishnan, S. Ladame Chem. Eur. J. 2008, 14(28),

17 Thanks to... Dr. Sylvain LADAME (PhD Supervisor) Dr Yamuna Krishnan and Ms Poulami Sengupta (Mass Spec)

18 Questions ?

19 Suggested modes of interaction

20 PNA 1 (ligand de première génération) peut piéger lADN télomérique simple brin dans une conformation de G4, même en milieu très faiblement salin (Premier exemple de quadruplex bimoléculaire hybride mimant une structure dintérêt biologique) mais… Il nest pas capable « denvahir » un quadruplex bimoléculaire dADN en déplaçant le brin dADN quil est sensé mimer. doù Développement de ligands de seconde génération de type Acridone-PNA-Acridone afin daugmenter la stabilité du quadruplex hybride et favoriser linvasion des quadruplexes.

21 Localisation des G-quadruplexes dans le génome : Hasard ou rôle biologique ? 43% des gènes possèdent, dans la région de leur promoteur, une séquence pouvant potentiellement former un quadruplex dADN. HASARD ou FONCTION BIOLOGIQUE ? Quadruplexes localisés dans la région des promoteurs doncogènes = possibles éléments régulateurs de transcription.

22 Ligands de G4 ciblent presque tous la tétrade de G supérieure du quadruplex Structure aux rayons X du quadruplex télomérique humain presque toujours utilisée comme cible modèle.

23 Exemple de loncogène c-myc : Mutation dun résidu G en A = impossibilité de former un G4 = surexpression de c-myc Stabilisation du G4 par ligand de type porphyrine = baisse du niveau dexpression de c-myc. d(TGGGGAGGGTGGGGAGGGTGGGGAAGG) Seenisamy J, Rezler EM, Powell TJ, Tye D, Gokhale V, Joshi CS, Siddiqui-Jain A, Hurley LH. J.Am.Chem.Soc. 2004, 126, 8702

24 G4, un hymne à la faveur de linterface chimie/biologie G-quadruplex = formidable construction supramoléculaire résultant dune possible pré-organisation de résidus guanines en tétrades planes via formation de liaisons hydrogènes de type Hoogsteen… Suscite lintérêt des chimistes supramoléculaires pour la construction de nano (ou macro) structures (moteurs) basées sur cet auto- assemblage… MAIS AUSSI G-quadruplexes = Cibles thérapeutiques potentielles au niveau de lADN télomérique ou au niveau des promoteurs de gènes…mythe ou réalité ?? Ces structures existent-elles in vivo et si oui, quel rôle peuvent-elles bien jouer et comment peut-on les cibler dans un but thérapeutique ?…Suscite lintérêt de chimistes bioorganiciens pour la conception de nouveaux agents thérapeutiques.

25 Elongation des télomères assurée par une polymérase à ADN : LA TELOMERASE ribonucléoprotéine qui utilise une région de son ARN interne comme matrice pour la synthèse de lADN télomérique. Télomérase humaine : Cible thérapeutique car active dans % des cellules tumorales. Blocage de lextrémité 3 simple brin des télomères sous forme de quadruplex = inhibition du processus délongation par les télomérases. Molécules induisant le formation de ces structures = possible activité anticancéreuse

26 From Luu KN, Phan AT, Kuryavyi V, Lacroix L, Patel DJ. JACS 2006, 128(30), pp G-tetradloops (TTA)

27 STRATEGIE + d(GGGTTAGGGTTAGGG)

28 Données expérimentales complémentaires - PNA 1 réagit de façon spécifique avec G3…mais est incapable de former des duplexes stables avec un ADN simple brin complémentaire ou « denvahir » et stabiliser une double hélice dADN (même si cette dernière contient un motif CCC) - Un PNA de type Lys-GGG-NH 2 peut former un quadruplex hybride avec G3 MAIS Uniquement dans des conditions riches en sel Ces quadruplexes hybrides sont moins stables que ceux formé avec PNA-acridone

29 - Augmente quand PNA 1 incubé avec G3 - Ne change pas quand PNA 1 incubé avec ssDNA Titrations de fluorescence dune solution de PNA 1 (3 µM) avec : - G3 prefolded as a dimeric quadruplex (vert) - G3 but unfolded in water (bleu) Fluorescence spectroscopy exc acridone = 410 nm

30 Human telomeres : sequence d(TTAGGG) n Telomeres: witnesses of cellular ageing, shortened after each cell division. Telomeric DNA critical length inducing cell's death by apoptosis