FISH- Ә ДІСТІ Қ ОЛДАНУ Орындағандар:Абузарова М. Әліқул А. Мынбаева Д. ХБТ 1311. - презентация

1 FISH- Ә ДІСТІ Қ ОЛДАНУ Орындағпандар:Абузарова М. Әліқул А. Мынбаева Д. ХБТ 1311

2 Ф ЛУОРЕСЦЕНТТІК ГИБРИДИЗАЦИЯ IN SITU, НЕМЕСЕ FISH Ә ДІСІ ( АНГЛ. FLUORESCENCE IN SITU HYBRIDIZATION FISH ), Цитогенетикада қолданналатын әдіс. Метафазалық хромосомалардың, интерфазалық ядро ДНҚ тізбегін аннақтауға көмектеседі. Соңғы кездері гендердің экспрессия сын бақылауда қолданналлоды. FISH әдісін преимплантациондық, пренатал ьдық және постнатальдық генетикалық диагностика да, онкологиялық аурулар диагностика лауда қолданнасқа ие.

3 З ОНДТАР флуоресцентті гибридизация in situ ДНК-зондтарды қолданналлоды. Олар берілген мысалға комплементарна байланнасады. Зондтарға: Нуклеозидтер, флюоролдар, биотин, диоксигенин т.б кіреді. Таңбаланған зондтарды гибридизация аяқталысы мен флюоросцентті микроскоп көмегімен көруге болады.

4 ДНҚ ЗОНДПЕН БЕЛГІЛЕУ Тікелей белгілеу т ү рі - флюорофтармен белгіленген нуклеозидтер. Нысанамен байланнас қ ан ДНК-зондты гибридизация біткеннен кейін бірден флуоресцентті микроскопта к ө руге болады. Тікелей емс белгілеу т ү рі - нуклеозидтерді биотин немсе диоксигенинмен белгілейді. Ол кезде қ осымша бояу процедура лары ж ү ргізіледі. Биотинді флуоресцентті белгіленген авидинмен, ал дигоксигенинді флуоресцентті белгіленген антиденелермен анна қ тайна.

5 Д ИАГНОСТИКАЛЫҚ ДНҚ ЗОНДТТАРДЫ ӨҢДЕУ ДН Қ зондттарды биотиндеу ке ң тарал ғ ан ә діс.Биотинделген зонд пен насаналы ДН Қ -на гибридизациялайды.

6

7

8

9 П РЕПАРАТ ДАЙЫНДАУ ЖОЛДАРЫ Басында ДНК пробанна тритиймен белгілейді (3Н). Кейін пробанна 5 мин 100 °С 20 мкл құрамында 2XSSC, 50 % формамидаДО % декстран сульфата және 1-3 хЮ5 -имп/мин радиоактивті ДНК бар гибридизациялық смесите қыздыру арқилы денатурациялайды; Хромосомалық ДНК-на да заттық шынада 0,07 М NaOH ерітіндісінде 30 сек аралығында және 96°(2 рейт) 5 мин спирт пен шаю арқилы денатурлейді. Гибридизацияна 18 сағатта 37 С температурада жүргізеді, Препаратты 2XSSC екі рейт, 50 % формамидпен 39 С-та 5 мин аралығында, екі рейт 96° этанолмен 5 мин аралығында шаяды. Препаратты ауада эмульсиялық жамылғы арқилы кептіреді; Эмульсия астында препарат экспозициясы орта мәнде 6-дан 12 күнге дейін баруы мүмкін. Содна кейін хромосомалық препараттарды амидті айқындағышта аннақтайна және 30 % Райт бояғышынаң ерітіндісінде және в 0,02М фосфаты буферде рН= 6,8 бояйды. Радиоавтографтар анализдік талдайды да сурейтке түсіреді. Басында ДНК пробанна тритиймен белгілейді (3Н). Кейін пробанна 5 мин 100 °С 20 мкл құрамында 2XSSC, 50 % формамидаДО % декстран сульфата және 1-3 хЮ5 -имп/мин радиоактивті ДНК бар гибридизациялық смесите қыздыру арқилы денатурациялайды; Хромосомалық ДНК-на да заттық шынада 0,07 М NaOH ерітіндісінде 30 сек аралығында және 96°(2 рейт) 5 мин спирт пен шаю арқилы денатурлейді. Гибридизацияна 18 сағатта 37 С температурада жүргізеді, Препаратты 2XSSC екі рейт, 50 % формамидпен 39 С-та 5 мин аралығында, екі рейт 96° этанолмен 5 мин аралығында шаяды. Препаратты ауада эмульсиялық жамылғы арқилы кептіреді; Эмульсия астында препарат экспозициясы орта мәнде 6-дан 12 күнге дейін баруы мүмкін. Содна кейін хромосомалық препараттарды амидті айқындағышта аннақтайна және 30 % Райт бояғышынаң ерітіндісінде және в 0,02М фосфаты буферде рН= 6,8 бояйды. Радиоавтографтар анализдік талдайды да сурейтке түсіреді.

10 Г ИБРИДИЗАЦИЯ ПРОЦЕСІ Зонд құ растыру. Зонд гибридизация ж ү рейтін сайтт ү шін жеткілікті м ө лшерде болуы керек. (1000 нан к ө п емс) Интерфазалы қ ядро мен метафазалы қ хромосома дан затты қ шынада препарат дайындау. ДН Қ екі тізбекті бокса она денатурормамид қ осу ар қ илы денатурация кезінде хромосомаларды ң морфологиясы мен ядрона ң денатурация сын 70 С дейін т ө мендетеді Препарат қ а зонд қ осып 12 са ғ ат гибридизациялаймыз. Қ осылмай қ ал ғ ан зондтарды шайып кетіреміз Флюоросцентті микроскоппен ба қ ылаймыз

11

12 ЖЕКЕ Ғ ЫЛЫМИ МА Қ АЛА К Ө ЗІ БОЙЫНША

13 Бай қ ош қ арова С.Б. ДЕНЕДЕН ТЫС Ұ РЫ Қ ТАНДЫРУ БА Ғ ДАРЛАМАСЫНДА АНЕУПЛОИДТЫ АБЕРРАЦИЯЛАРДЫ АНЫ Қ ТАУ («Экомед» адам а ғ за сына н тыс ұ ры қ тандыру емханасы) FISH-диагностиканна ж ү ргізу барысында анна қ тал ғ ан анеуплоидияларды ң жиілігі мен кейбір физиологиялы қ факторлар арасында т ə уелділік бар екендігі белгілі балды, сонамен қ атар оларды ң жиілігіне репродуктивтік анамнезді ң ə сер ететіндігі анна қ талды.

14 1967 жилы R.Edwards жəне R.Gardner клиникалық тəжірибеде бірінші рейт имплантацияға дейінгі генетикалық диагностика (ИГД) əдісін қоян эмбрионанаң жынасын аннақтау үшін қолданды. Сол кездің өзінде ИГД-на адама генетикалық аурулардың тұқым қуалауын шектеу үшін пайдалану ойлары туындаған болатын. 80 ж. аяғында осы əдісті тұқым қуалаушилық ауруларды өзінің ұрпағына берілу қаупі жеғары ерлі-зайыпты жұптарға көмектесу мақсатында қолданналды. 90 ж. басында қрай, жеке жасушалардағы мутацияларды аннақтауға мүмкіндік берейтін, полимеразды тізбектік реакция (ПТР) əдісі ойлап табылды ж. бірінші болып адамға ПТР əдісін имплантацияға дейінгі генетикалық диагностика жүргізу мақсатында A.Handyside жəне онаң əріптестері қолданған. Олар Х-хромосомасымен тіркескен аурулары бар ерлі-зайыпты жұпетардың эмбрион дарынаң жынасын аннақтау мақсатында, ПТР əдісінің негізінде Y-хромосомасын сипаттайтын нуклеотидтердің спецификалық тізбектерін зерттеген болатын. Бірақ эмбрион дарды аннақтау барысында жалған диагноз қою қаупі бар болғандықтан ПТР-дан біртіндеп in situ жағдайындағы флуоресценттік гибридизация (FISH) жасау əдісіне ауыса баста ты. Бұл əдістің артықшилығы Х жəне Ү-хромосомаларын бір уақытта аннақтауға болады. Осынаң арқасында эмбрион дардың тек жынасын аннақтаумен ғана емс, сонамен қатар жынас хромосомаларынаң анеуплоидия сын да аннақтауға мүмкіншілік туады

15 Бүгінгі күні генетикалық аномалия лары бар балаларды ту қауіпі бар, əйелдер тобин аннақтайтын скринингтік бағдарламалардың елеулі дəрежете жетілдірілуіне қарамастан, жаңа жағдайлар мəселельердің жаңа шешімін талап етеді. Бедеулікке шалдыққан ерлі-зайыпты жұптарға ИГД жүргізу арқилы, қосалқы репродуктивтік технологиялардың көмегімен олардың емделуін елеулі дəрежете жеғарлатуға болады. Сонамен қатар тұқым қуалайтын аурулары бар балалардың туылуын шектеуге мүмкіндік береді. Инвазивті пренатальдық диагностика əдістерінің көмегімен ұрықтың генетикалық ауруларын аннақтағпанда, жүктілікті тоқтату қажеттілігі пайда болуы мүмкін. Ал имплантацияға дейінгі генетикалық диагностика əдісі бастапқыдан сау эмбрион дармен жүкті болуды көздейді.

16 ИГД жүргізуге көрсетілетін жағдайлар: 1. Хромосомалық немсе гендік аурулары бар бокса, немсе осы аурулар бойынша тасымалдаушы бокса, генетикалық патологиясы бар бала ту қауіпін азайту мақсатында: Клайнфельтер, Шершевский-Тернер жəне т.б. синдром дары бойынша мозаицизм бокса; Кариотипте робертсондық транслокациялар, маркерлік хромосомалар жəне т.б. қайтақұрилымдар болған жағда-да; муковисцидоз, гемофилия, Гентингтон ауруы сияқты жəне т.б. моногендік аурулармен аурыатын жағда-да немсе осы аурулар бойынша тасымалдаушы бокса. 2. Кариотиптерінде хромосомалар саннанаң аномалия лары бар эмбрион дарды «жіктеу» көмегімен, денеден тыс ұрықтандыру (ДТҰ) бағдарламасынаң тиімділігін арттыру мақсатында: əйелдердің уужасы 35 тен жеғары болғпанда; Нашар ДТҰ болжамы бар əйелдерге (жүктіліктің арте мерзімдерінде үш немсе одна да көп өздігінен болған түсіктер бокса); үш немсе одна да көп сəтсіз аяқталған ДТҰ/ИКСИ бағдарламалары бокса; еркектердің сперматогенез үрдісінде ауры бұзилыстар бокса. Жоғарыда келтірілген генетикалық көрсетілімдер тізімі ИГД əдісінің жетілдірілуіне жəне онаң кең мүмкіндіктеріне байланнасты жил сайтын толықтырилып отыратына аннақ.

17 Біздің жүргізілген зерттеулерімізде анеуплоидтық абберацияларды FISH əдісінің көмегімен аннақтадық, ол үшін 13, 18, 21, X, Y хромосомаларын аннақтауға арналған «Vysis» фирмасынаң Multivysion PGT ДНҚ-зондтарын қолдандық. Зерттеу жұмысына ДТҰ (денеден тыс ұрықтандыру) жəне ИГД (имплантацияға дейінгі генетикалық диагностика) бағдарламаларынан өткен 54 əйел іріктелініп алтынды. Біздер өз тəжірибелерімізде жас көрсеткіштеріне тəуелсіз əйелдерді репродуктивтік статусы бойынша үш топқа (донорлық ооциттер қолданған əйелдер чччтобы, беду əйелдер чччтобы, еркектік бедулігі бар əйелдер чччтобы, соңғы торта əйелдерінің репродуктивтік жүйесі қалыпты болған) бөлдік. Бірінші косте де зерттеуге алтынған əйелдерге жалпы сипаттама берілген. Эмбриондардың ИГД жасау əдістемсі екі сатыдан тұрады – бластомер биопсиясы жəне бластомердің фиксацияланған ядро сын молекулалық-цитогенетикалық FISH-əдісімен зерттеу.

18 Ə детей ү шінші т ə улікте лабораториялы қ жа ғ да-да ə рбір эмбриона Narishige фирмасына ң микроманипуляторларына ң к ө мегімен бір бластомер алтынады. Ядро фиксация сажал ғ аннан кейін, затты қ шынада ғ ы орнан алмазды қ аламна ң к ө мегімен белгілейміз. Ə рі қ рай ерлі-зайыпты ж ұ пты ң анамнезіне байланнасты қ ажетті хромосомалар ғ а FISH-диагностика ж ү ргізіледі. Осы FISH- диагностиканна ң н ə тижелері бойынша ə йелді ң жатыр қ уысына 1-2 генетикалы қ жа ғ ынан «сау» деп таннал ғ ан эмбрион дар тасымалданады

19 Сонамен бірге эмбрион дарды ң бластоциста ғ а айналу к ө рсеткіші бойынша ж ү ргізілген зерттеу ж ұ мыстарынан алтын ғ ан м ə ліметтер келесідей н ə тижелер к ө рсетті. Эуплоидты эмбрион дар арасында атал ғ ан к ө рсеткішті ң де ң гейіні ң (60,9%; 55,4%; 63,6%) анеуплоидты эмбрион дармен салыстыр ғ панда (с ə йкесінше 39,1%; 44,6%; 36,4%) же ғ ары бол ғ аннамен, анеуплоидты эмбрион дар арасында қ алыпты бластоцисталарды ң пайда болуы эмбрион дарды ң морфологиялы қ к ө рсеткіштеріні ң, генетикалы қ құ романны сайт келмейтініне д ə лель бола аллоды.

20 ДТ Ұ БА Ғ ДАРЛАМАСЫНЫ Ң АЯСЫНДА Ж Ү РГІЗІЛГЕН ЗЕРТТЕУ Ж Ұ МЫСЫНДА АЛЫН Ғ АН М Ə ЛІМЕТТЕР НЕГІЗІНДЕ КЕЛЕСІДЕЙ Қ ОРЫТЫНДЫЛАР ЖАСАУ Ғ А БОЛАДЫ : 1. Ə йелдерді ң уужасы мен анеуплоидиялар арасында белгілі бір д ə режете о ң корреляция болатынды ғ ы анна қ талды. Осы ғ ан орай ДТ Ұ ба ғ дарламаларынан ө тіп жат қ ан ерлі-зайыпты ж ұ петарды ң кариотипіне зерттеу ж ү ргізу ұ сыналды. 2. FISH- ə дісіні ң к ө мегімен анна қ таланты анеуплоидияларды ң жиілігіне ə йелдерді ң репродуктивтік статусы ə сер ететіндігі анна қ талды. Донорлы қ ооциттер қ олданналатын ба ғ дарламаларда ИГД ə дісін ж ү ргізу қ ажеттігі бар екені айтылды. 3. ДТ Ұ ба ғ дарламаларында алтынатын эмбрион дарды ң морфологиялы қ к ө рсеткіштері она ң генетикалы қ жиынты ғ ына ң қ алыпты екеніне кепіл бола алмайтына д ə лельденді.