Род ЛИСТЕРИЯ LISTERIA. Листерии впервые были выделены в 1926 г. англ. микробиологом Мюрреем во время эпизоотии у лабораторных животных в питомнике Кембриджского. - презентация

1 Род ЛИСТЕРИЯ LISTERIA

2 Листерии впервые были выделены в 1926 г. англ. микробиологом Мюрреем во время эпизоотии у лабораторных животных в питомнике Кембриджского университета Листерии впервые были выделены в 1926 г. англ. микробиологом Мюрреем во время эпизоотии у лабораторных животных в питомнике Кембриджского университета у всех заболевших кроликов отмечался моноцитоз

3 Мюррей назвал м/о Bacterium monocytogenes Мюррей назвал м/о Bacterium monocytogenes В 1929 г. листерии были выделены от овец (одного из основных хозяев листерий) и от человека В 1929 г. листерии были выделены от овец (одного из основных хозяев листерий) и от человека В 1940 г. м/о был назван LISTERIA в честь англ. хирурга Листера

4 До 80-х годов листерии у человека выделяли исключительно редко До 80-х годов листерии у человека выделяли исключительно редко С 1930 г. по 1980 г. в мире было зарегистрировано всего около 2000 случаев заболевания листериозом С 1930 г. по 1980 г. в мире было зарегистрировано всего около 2000 случаев заболевания листериозом Листериоз отмечался в сельской местности - у людей, контактировавших с животными (доярок, пастухов, фермеров) Листериоз отмечался в сельской местности - у людей, контактировавших с животными (доярок, пастухов, фермеров)

5 С 80-х годов стали регистрироваться вспышки и спорадические случаи листериоза, связанные с употреблением пищевых продуктов С 80-х годов стали регистрироваться вспышки и спорадические случаи листериоза, связанные с употреблением пищевых продуктов Крупнейшей является вспышка 1985 г. в Лос-Анджелесе, связанная с употреблением сычужного сыра. Было выявлено 142 больных, из них 48 – погибло Крупнейшей является вспышка 1985 г. в Лос-Анджелесе, связанная с употреблением сычужного сыра. Было выявлено 142 больных, из них 48 – погибло С тех пор листериоз стали рассматривать, как одну из пищевых инфекций С тех пор листериоз стали рассматривать, как одну из пищевых инфекций

6 Листериоз – зооантропоноз Листериоз – зооантропоноз Возбудитель выделяют от более, чем 100 видов животных – домашних (овец, коз, коров, свиней), грызунов; птиц; рыб; моллюсков; насекомых (клещей, блох) Возбудитель выделяют от более, чем 100 видов животных – домашних (овец, коз, коров, свиней), грызунов; птиц; рыб; моллюсков; насекомых (клещей, блох)

7 У животных отмечают : У животных отмечают : аборты, аборты, маститы, маститы, поражения нервной системы, поражения нервной системы, септик. явления септик. явления Возможно здоровое носительство Возможно здоровое носительство

8 Основной резервуар возбудителя в природе грызуны Основной резервуар возбудителя в природе грызуны С-х. животные чаще всего заражаются через воду, корма, загрязнённые выделениями грызунов С-х. животные чаще всего заражаются через воду, корма, загрязнённые выделениями грызунов

9 Листерии очень устойчивые микроорганизмы Листерии очень устойчивые микроорганизмы Длительно сохраняются в окружающей среде: Длительно сохраняются в окружающей среде: до 3-х лет в почве до 3-х лет в почве в воде – 2-3 года в воде – 2-3 года в кормах животных (фураже, силосе), в пищевых продуктах – многие месяцы в кормах животных (фураже, силосе), в пищевых продуктах – многие месяцы

10 Температурный диапазон роста от 1 до +44° (размножаются в условиях холодильника) Температурный диапазон роста от 1 до +44° (размножаются в условиях холодильника) Листерии остаются жизнеспособными и при более высоких температурах (до 60°) Листерии остаются жизнеспособными и при более высоких температурах (до 60°) Не погибают при замораживании Не погибают при замораживании Температурный оптимум ° Температурный оптимум ° Растут в диапазоне рН от 6 до 9 Растут в диапазоне рН от 6 до 9 Оптимальная рН 7,0-7,4 Оптимальная рН 7,0-7,4 Выдерживают высокие концентрации соли – 15-24% Выдерживают высокие концентрации соли – 15-24%

11 Пути заражения Листерии проникают в организм через слизистую пищеварительной системы, дыхательных путей глаз, зева Листерии проникают в организм через слизистую пищеварительной системы, дыхательных путей глаз, зева 1. Пищевой путь - при употреблении инфицированных пищевых продуктов (молока, сыра, мяса, рыбы, салатов, соков и пр.) 1. Пищевой путь - при употреблении инфицированных пищевых продуктов (молока, сыра, мяса, рыбы, салатов, соков и пр.) 2. Трансмиссивный путь - при укусе насекомых (клещей, блох) 2. Трансмиссивный путь - при укусе насекомых (клещей, блох)

12 3. Контактный (от больных животных) 3. Контактный (от больных животных) 4. Аэрогенный (редко) 4. Аэрогенный (редко) 5. Трансплацетарный путь 5. Трансплацетарный путь 6. Заражение в родах 6. Заражение в родах

13 Формы листериоза Инкубационный период от 10 до 60 дней Инкубационный период от 10 до 60 дней Формы: Формы: 1. Ангинозная форма – лихорадка, ангина, конъюнктивит, увеличение лимфоузлов 1. Ангинозная форма – лихорадка, ангина, конъюнктивит, увеличение лимфоузлов 2.Менингиты, энцефалиты 2.Менингиты, энцефалиты 3. Эндокардиты 3. Эндокардиты 4. Септическая форма 4. Септическая форма

14 5. Пищевая инфекция - проявляется тошнотой, рвотой, болями в животе, поносом, повышением температуры до 38–39 градусов 5. Пищевая инфекция - проявляется тошнотой, рвотой, болями в животе, поносом, повышением температуры до 38–39 градусов Нередко через 3–4 дня состояние больного резко ухудшается, появляются признаки поражения ЦНС (менингит, энцефалит) Нередко через 3–4 дня состояние больного резко ухудшается, появляются признаки поражения ЦНС (менингит, энцефалит)

15 6. Листериоз беременных и новорожденных 6. Листериоз беременных и новорожденных При беременности чаще возникает листериоз, но беременные обычно болеют в латентной форме При беременности чаще возникает листериоз, но беременные обычно болеют в латентной форме Отмечают выкидыши, аномалии плода Отмечают выкидыши, аномалии плода У новорожденных – менингиты и энцефалиты

16 От человека человеку практически не передается От человека человеку практически не передается Для всех форм - высокий моноцитоз Для всех форм - высокий моноцитоз Заболеваемость листериозом низкая: Заболеваемость листериозом низкая: в США регистрируют до 3000 случаев в год в США регистрируют до 3000 случаев в год на Украине до 30 случаев в год на Украине до 30 случаев в год Высокая смертность – 20%-40% Высокая смертность – 20%-40%

17 Классификация Род Листерия по Берджи относится к 19 группе – Гр+ неспорообразующие палочки правильной формы Род Листерия по Берджи относится к 19 группе – Гр+ неспорообразующие палочки правильной формы Включает 7 видов Включает 7 видов В патологии человека и животных имеет значение 3 вида: В патологии человека и животных имеет значение 3 вида: 1. L. мonocytogenes – 90-95% патологии 1. L. мonocytogenes – 90-95% патологии 2. L. ivanovii % 2. L. ivanovii %

18 3. L. seeligeri – вызывает заболевание у человека исключительно редко 3. L. seeligeri – вызывает заболевание у человека исключительно редко Остальные виды и L. seeligeri являются почвенными сапрофитами и могут встречаться в пищевых продуктах Остальные виды и L. seeligeri являются почвенными сапрофитами и могут встречаться в пищевых продуктах

19 Морфология Листерии – мелкие Гр+ палочки с закругленными концами Листерии – мелкие Гр+ палочки с закругленными концами Размерами в ширину 0,5-1 мкм, в длину 1-3 мкм, иногда корковидной формы Размерами в ширину 0,5-1 мкм, в длину 1-3 мкм, иногда корковидной формы Склонны к полиморфизму, в старых культурах образуют нитевидные формы до мкм длиной Склонны к полиморфизму, в старых культурах образуют нитевидные формы до мкм длиной

20 Подвижны при 20°-25°С Подвижны при 20°-25°С Имеют 1 или несколько жгутиков Имеют 1 или несколько жгутиков При 37°C - неподвижны При 37°C - неподвижны Факультативные анаэробы Факультативные анаэробы

21 В мазке располагаются беспорядочно В мазке располагаются беспорядочно Могут располагаться в виде частокола или V и Yформы, напоминая коринебактерии Могут располагаться в виде частокола или V и Yформы, напоминая коринебактерии

22

23 Культуральные свойства Листерии не относятся к числу микроорганизмов, культивирование которых представляет какие-либо трудности Листерии не относятся к числу микроорганизмов, культивирование которых представляет какие-либо трудности Для посева на листерии можно использовать широкий спектр питательных сред – МПА, сывороточный и кровяной агар, триптиказо-соевый агар и т. д. Для посева на листерии можно использовать широкий спектр питательных сред – МПА, сывороточный и кровяной агар, триптиказо-соевый агар и т. д.

24 Растут на простых средах, но медленно, поэтому к МПА добавляют Растут на простых средах, но медленно, поэтому к МПА добавляют глюкозу (1%) глюкозу (1%) или глицерин (2%) или глицерин (2%) Оптимальная среда глюкозо (1%), глицерина (2%), сывороточный (3- 5%) агар Оптимальная среда глюкозо (1%), глицерина (2%), сывороточный (3- 5%) агар

25 На глюкозо-глицерин-сывороточном агаре колонии нежные, прозрачные голубовато-серые, круглые, выпуклые до 3 мм На глюкозо-глицерин-сывороточном агаре колонии нежные, прозрачные голубовато-серые, круглые, выпуклые до 3 мм Рост через 24 часа Рост через 24 часа

26 На МПА с 1% глюкозы образуют мелкие (0,5-2 мм) голубовато-серые круглые выпуклые колонии - росинки На МПА с 1% глюкозы образуют мелкие (0,5-2 мм) голубовато-серые круглые выпуклые колонии - росинки В первые сутки колонии еле заметны В первые сутки колонии еле заметны Характерный рост отмечается через 48 часов Характерный рост отмечается через 48 часов На КА через 24 часа образуют голубовато-белые колонии до 2 мм с бета или альфа гемолизом На КА через 24 часа образуют голубовато-белые колонии до 2 мм с бета или альфа гемолизом

27 При длительном культивировании могут образовывать R- формы - шероховатые, с утолщённым краем, диаметром 1-3 мм При длительном культивировании могут образовывать R- формы - шероховатые, с утолщённым краем, диаметром 1-3 мм S-R-переход сопровождается снижением гемолитической активности и потерей вирулентности S-R-переход сопровождается снижением гемолитической активности и потерей вирулентности На средах с глюкозой дают характерный запах творога или кислого молока На средах с глюкозой дают характерный запах творога или кислого молока

28 В жидких средах листерии дают равномерное помутнение, осадок В жидких средах листерии дают равномерное помутнение, осадок Осадок слизистый, плотный, иногда поднимается в виде косички Осадок слизистый, плотный, иногда поднимается в виде косички В полужидких средах листерии дают характерный рост по уколу, более обильный у поверхности с образованием «купола» и спускающегося вниз хвостика (зонтик) В полужидких средах листерии дают характерный рост по уколу, более обильный у поверхности с образованием «купола» и спускающегося вниз хвостика (зонтик)

29 Рост спорадических случаев и вспышек листериоза способствовал выявлению многочисленных уязвимых мест традиционной диагностики Рост спорадических случаев и вспышек листериоза способствовал выявлению многочисленных уязвимых мест традиционной диагностики Так, в мазках листерии морфологически могут быть сходны с дифтероидами и Гр+ кокками Так, в мазках листерии морфологически могут быть сходны с дифтероидами и Гр+ кокками

30 Выделение возбудителя из контаминированного клинического материала и продуктов питания оказалось малоэффективным без селективных компонентов Выделение возбудителя из контаминированного клинического материала и продуктов питания оказалось малоэффективным без селективных компонентов В 80-е годы были созданы селективные среды значительно повышающие эффективность выделения и сократившие сроки идентификации L.monocytogenes В 80-е годы были созданы селективные среды значительно повышающие эффективность выделения и сократившие сроки идентификации L.monocytogenes

31 Основные селективные компоненты, используемые при выделении листерий Основные селективные компоненты, используемые при выделении листерий Хлорид лития Хлорид лития Теллурит калия Теллурит калия Налидиксовая кислота Налидиксовая кислота Акрифлавин Акрифлавин Циклогексимид Циклогексимид Антибиотики (цефтазидим, полимиксин B) Антибиотики (цефтазидим, полимиксин B) Эскулин Эскулин

32 Селективные и дифференциально- диагностические среды МПА + 0,05% теллурита калия +2% глицерина +1% глюкозы. Добавление 5- 10% сыворотки крови улучшает рост листерий. Образуют колонии черного цвета МПА + 0,05% теллурита калия +2% глицерина +1% глюкозы. Добавление 5- 10% сыворотки крови улучшает рост листерий. Образуют колонии черного цвета Наибольшее распространение для выделения листерий получили Оксфорд агар и PALCAM агар Наибольшее распространение для выделения листерий получили Оксфорд агар и PALCAM агар

33 PALCAM - агар Состав - полимиксин, акрифлавин, лития хлорид, цефтазидим, эскулин, маннит, глюкоза, цитрат железа, фенол.-красный Состав - полимиксин, акрифлавин, лития хлорид, цефтазидим, эскулин, маннит, глюкоза, цитрат железа, фенол.-красный Среда красного цвета Среда красного цвета Листерии гидролизуют эскулин, который реагируя с цитратом железа образует коричнево-черный комплекс Листерии гидролизуют эскулин, который реагируя с цитратом железа образует коричнево-черный комплекс

34 Через 24 ч. листерии образуют колонии диаметром 1-2 мм серо- зеленого цвета с черным ободком и черным центром Через 24 ч. листерии образуют колонии диаметром 1-2 мм серо- зеленого цвета с черным ободком и черным центром Большинство м/о подавляется Большинство м/о подавляется Стафилококки и энтерококки образуют оранжевые и желтые колонии (за счет ферментации маннита) без почернения Стафилококки и энтерококки образуют оранжевые и желтые колонии (за счет ферментации маннита) без почернения

35 Рост Listeria monocytogenes на селективном агаре PALCAM

36 Оксфорд-агар (и бульон) Состав – литий, эскулин, глюкоза, цитрат железа, акрифлавин, колистин, фосфомицин Состав – литий, эскулин, глюкоза, цитрат железа, акрифлавин, колистин, фосфомицин Среда темно-янтарного цвета Среда темно-янтарного цвета Через часов вырастают колонии серого цвета до 2 мм с темным ореолом Через часов вырастают колонии серого цвета до 2 мм с темным ореолом В бульоне – помутнение, потемнение, осадок В бульоне – помутнение, потемнение, осадок

37 Рост L. monocytogenes на Оксфордском агаре

38 В качестве сред обогащения обычно используют различные варианты триптиказо-соевого бульона с дрожжевым экстратом и селективными компонентами В качестве сред обогащения обычно используют различные варианты триптиказо-соевого бульона с дрожжевым экстратом и селективными компонентами Бульон Фрезера Бульон Фрезера

39 Среды разработанные ИМИ им. И.И. Мечникова Среда обогащения для бактериальных форм листерий (СОБФЛ) – МПБ, LiCl, налидиксовая к-та, глюкоза Среда обогащения для бактериальных форм листерий (СОБФЛ) – МПБ, LiCl, налидиксовая к-та, глюкоза Среда обогащения для L-форм листерий (СОLФЛ) (+ NaCl, 5% сыворотки) Среда обогащения для L-форм листерий (СОLФЛ) (+ NaCl, 5% сыворотки) ЛНЭАЛ - элективный агар для листерий ЛНЭАЛ - элективный агар для листерий ЛНЭАЛ-L- элективный агар для L-форм ЛНЭАЛ-L- элективный агар для L-форм

40 Биохимические свойства Каталаза + Каталаза + Оксидаза - Оксидаза - Ферментируют с образованием кислоты (без Г) глюкозу, мальтозу, рамнозу, эскулин, салицин Ферментируют с образованием кислоты (без Г) глюкозу, мальтозу, рамнозу, эскулин, салицин Не ферментируют маннит Не ферментируют маннит Индол- Индол- Н2S - Н2S - Мочевину не гидролизуют Мочевину не гидролизуют МК и ФП+ МК и ФП+

41 Антигены У листерии выделяют О- и Н- антигены У листерии выделяют О- и Н- антигены По структуре 14 соматических О-Аг и 5 Н-АГ выделено 16 сероваров: 1/2 а, 1/2 в, 1/2 с, 3 а-с, 4 а-d, 5, 6, 7. По структуре 14 соматических О-Аг и 5 Н-АГ выделено 16 сероваров: 1/2 а, 1/2 в, 1/2 с, 3 а-с, 4 а-d, 5, 6, 7. Три серовара (1/2 а, l/2b, 4b ) вызывают 90% всех случаев листериоза человека Три серовара (1/2 а, l/2b, 4b ) вызывают 90% всех случаев листериоза человека Имеются диагностикумы для РИФ, ИФА Имеются диагностикумы для РИФ, ИФА

42 Факторы патогенности Листериозин О –гемолизин, обладает токсическим эффектом. Способствует размножению листерий в фагоцитах Листериозин О –гемолизин, обладает токсическим эффектом. Способствует размножению листерий в фагоцитах ЛПС – эндотоксин (листерия единственная Гр+ бактерия, которая имеет ЛПС сходный с Гр- ЛПС) ЛПС – эндотоксин (листерия единственная Гр+ бактерия, которая имеет ЛПС сходный с Гр- ЛПС) Ферменты патогенности (лецитиназа, фосфолипаза и др.) Ферменты патогенности (лецитиназа, фосфолипаза и др.)

43 Этапы взаимодействия с клеткой организма Лизис первичной вакуоли Лизис первичной вакуоли Деление в цитоплазме клетки Деление в цитоплазме клетки Полимеризация актина, необходимая для передвижения листерий по цитоплазме Полимеризация актина, необходимая для передвижения листерий по цитоплазме Проникновение в соседнюю клетку путем продавливания мембраны и образования инвагинации в соседнюю клетку Проникновение в соседнюю клетку путем продавливания мембраны и образования инвагинации в соседнюю клетку Новый цикл деления в соседней клетке. Новый цикл деления в соседней клетке.

44 Проникновение в соседнюю клетку

45 Лабораторная диагностика Кровь Кровь 1. Засевают в количестве 10 мл в 100 мл селективной среды (Оксфорд-бульон, Фрейзера, СОБФЛ) 1. Засевают в количестве 10 мл в 100 мл селективной среды (Оксфорд-бульон, Фрейзера, СОБФЛ) 2. В случае отсутствия - в МПБ с 1% глюкозы 2. В случае отсутствия - в МПБ с 1% глюкозы 3.0,5 мл из бульона засевают на плотную селективную среду. В случае отсутствия на МПА+1% глюкозы+2%глицерина. 3.0,5 мл из бульона засевают на плотную селективную среду. В случае отсутствия на МПА+1% глюкозы+2%глицерина.

46 СМЖ центрифугируют СМЖ центрифугируют - из осадка делают мазки, окрашивают - из осадка делают мазки, окрашивают 1. по Граму 1. по Граму 2. иммунофлюоресцентной листериозной сывороткой 2. иммунофлюоресцентной листериозной сывороткой - посев на плотную селективную среду (или МПА + глюкоза + глицерин) и 5% КА - посев на плотную селективную среду (или МПА + глюкоза + глицерин) и 5% КА мл в жидкую селективную среду или МПБ с 1% глюкозы мл в жидкую селективную среду или МПБ с 1% глюкозы

47 Моча, околоплодные воды (как СМЖ) Моча, околоплодные воды (как СМЖ) Отделяемое из зева, носа, глаз и влагалища втирают в плотную селективную среду Отделяемое из зева, носа, глаз и влагалища втирают в плотную селективную среду Затем тампон отмывают в 1 мл физ. р-ра и смывную жидкость вносят в 5 мл жидкой селективной среды Затем тампон отмывают в 1 мл физ. р-ра и смывную жидкость вносят в 5 мл жидкой селективной среды

48 Испражнения, меконий : Испражнения, меконий : - 1 г засевают в жидкую селективную среду обогащения в соотношении 1:5-1: г засевают в жидкую селективную среду обогащения в соотношении 1:5-1: ,5 мл после суспенд. в жидкой среде засевают на плотные селективные среды - 0,5 мл после суспенд. в жидкой среде засевают на плотные селективные среды

49 Из трупных органов и тканей делают по 2 мазка-отпечатка и окрашивают Из трупных органов и тканей делают по 2 мазка-отпечатка и окрашивают 1. по Граму 1. по Граму 2. иммунофлюоресцентной сывороткой. 2. иммунофлюоресцентной сывороткой. Ткани гомогенизируют с физ. р-ром в соотношении 1:5 и высевают 0,5 мл на плотные и 2 мл в жидкие селективные среды. Ткани гомогенизируют с физ. р-ром в соотношении 1:5 и высевают 0,5 мл на плотные и 2 мл в жидкие селективные среды. Посевы инкубируют при 37 о ч. Посевы инкубируют при 37 о ч.

50 2 этап. Через часов при наличии роста из подозрительных колоний делают мазки, окрашивают по Граму и РИФ 2 этап. Через часов при наличии роста из подозрительных колоний делают мазки, окрашивают по Граму и РИФ С плотных сред пересев на скошенный МПА с 1% глюкозы для накопления чистой культуры С плотных сред пересев на скошенный МПА с 1% глюкозы для накопления чистой культуры Со сред обогащения через 48 часов ( не зависимо от наличия роста) пересев на глюкозо-глицерин-сывороточный агар и на 5% КА (при отсутствии роста через 72 ч. – отрицательный ответ) Со сред обогащения через 48 часов ( не зависимо от наличия роста) пересев на глюкозо-глицерин-сывороточный агар и на 5% КА (при отсутствии роста через 72 ч. – отрицательный ответ)

51 3 этап. Идентификация культуры: 3 этап. Идентификация культуры: Окраска по Граму (короткие Гр+ палочки) Окраска по Граму (короткие Гр+ палочки) Каталаза (+) Каталаза (+) Определение подвижности – посев в 2 пробирки с полужидким агаром; инкубация при 25 и 37 о ч. (при 25 всегда подвижны – образуют «зонтик» у поверхности пробирки) Определение подвижности – посев в 2 пробирки с полужидким агаром; инкубация при 25 и 37 о ч. (при 25 всегда подвижны – образуют «зонтик» у поверхности пробирки) Учет гемолиза (чаще бета-гемолиз) Учет гемолиза (чаще бета-гемолиз) Посев на среды Гиса (с ксилозой, рамнозой, салицином) Посев на среды Гиса (с ксилозой, рамнозой, салицином)

52 САМР-тест с гемолитическими штаммами S. aureus и R. equi S. aureus и R. equi засевают на КА параллельными штрихами на расстоянии 5 см. S. aureus и R. equi засевают на КА параллельными штрихами на расстоянии 5 см. Перпендикулярно засевают до 6 штаммов исследуемых листерий на расстоянии 1 см друг от друга и 2 мм от линий стафилококка и родококка. Перпендикулярно засевают до 6 штаммов исследуемых листерий на расстоянии 1 см друг от друга и 2 мм от линий стафилококка и родококка. Инкубируют при 37 о ч. Инкубируют при 37 о ч.

53 L. мonocytogenes дает расширение зоны гемолиза возле стафилококка и отсутствие усиления гемолиза у родококка L. мonocytogenes дает расширение зоны гемолиза возле стафилококка и отсутствие усиления гемолиза у родококка L. ivanovii дает расширение зоны гемолиза возле родококка и отсутствие усиления гемолиза у стафилококка L. ivanovii дает расширение зоны гемолиза возле родококка и отсутствие усиления гемолиза у стафилококка При отсутствии в музее культуры родококка разрешается постановка теста только со стафилококком При отсутствии в музее культуры родококка разрешается постановка теста только со стафилококком

54 Дифференциальная диагностика L. мonocytogenes L. ivanovii L. мonocytogenes L. ivanovii Ксилоза - + Ксилоза - + Рамноза + - Рамноза + - САМР-тест стаф.+ стаф.- САМР-тест стаф.+ стаф.- L. мonocytogenes Corynebacterium L. мonocytogenes Corynebacterium Подвижность + - Подвижность + - Рост на селект. ср. + - Рост на селект. ср. + - Салицин + - Салицин + - эскулин + - эскулин + -

55 Выявление листерий в пищевых продуктах Метод гармонизирован с международным стандартом ISO Метод гармонизирован с международным стандартом ISO Проводится соответственно приказу 558 от 2006 г. и МУ «Организация контроля и методы выявления в пищевых продуктах и продовольственном сырье» Проводится соответственно приказу 558 от 2006 г. и МУ «Организация контроля и методы выявления в пищевых продуктах и продовольственном сырье» Применяются питательные среды международного образца Применяются питательные среды международного образца

56 1 день 1 день Готовят навески 25 г продукта и засевают в среду для первичного обогащения - бульон Фрезера с пониженной концентрацией а/б, в соотношении 1:9 (в 225 мл) Готовят навески 25 г продукта и засевают в среду для первичного обогащения - бульон Фрезера с пониженной концентрацией а/б, в соотношении 1:9 (в 225 мл) Инкубируют при 37 о 24 часа Инкубируют при 37 о 24 часа При появление роста – потемнение среды При появление роста – потемнение среды

57 2 день 2 день Независимо от наличия роста 0,1 мл пересевают в 10 мл бульона для вторичного обогащения (б-н Фрезера с полной концентрацией а/б) Независимо от наличия роста 0,1 мл пересевают в 10 мл бульона для вторичного обогащения (б-н Фрезера с полной концентрацией а/б) Инкубируют часов при 37 о Инкубируют часов при 37 о Потемнение среды при появлении роста Потемнение среды при появлении роста

58 3-4 день 3-4 день Независимо от наличия роста пересев по 0,1 мл на 2 чашки с плотной селективной средой Независимо от наличия роста пересев по 0,1 мл на 2 чашки с плотной селективной средой 1. Оксфорд-агар 1. Оксфорд-агар 2. PALCAM-агар 2. PALCAM-агар Инкубируют при 37 о часов Инкубируют при 37 о часов При отсутствии роста дается отрицательный результат При отсутствии роста дается отрицательный результат

59 При наличии роста: При наличии роста: PALCAM-агар – серо-зеленые с черным ореолом PALCAM-агар – серо-зеленые с черным ореолом Оксфорд-агар – серые с черным ореолом Оксфорд-агар – серые с черным ореолом Отбирают 3-5 колоний и пересевают: на ТСЕДА Отбирают 3-5 колоний и пересевают: на ТСЕДА Инкубируют при 37 о 24 ч. Инкубируют при 37 о 24 ч.

60 Из чистых культур делают мазки, красят по Граму (короткие Гр+ палочки) Из чистых культур делают мазки, красят по Граму (короткие Гр+ палочки) Тест на каталазу (+) Тест на каталазу (+) Определяют подвижность (2 пробирки инкубируют при 25 и при 37 в течение часов) Определяют подвижность (2 пробирки инкубируют при 25 и при 37 в течение часов) Определяют утилизацию маннита (-), ксилозы(-), рамнозы(+) Определяют утилизацию маннита (-), ксилозы(-), рамнозы(+) Постановка САМР-теста Постановка САМР-теста Определение лецитиназной активности Определение лецитиназной активности

61 Лецитиназная активность На среде с активированным углем и желтком L. мonocytogenes образует лецитиназу, дает зону помутнения вокруг колнии L. ivanovii образует лецитиназу на среде с углем и без угля Ост. листерии лецитиназу не образуют

62 Тест-система для идентификации листерий Микроген Listeria-ID Состав набора: 1) Стрипы с лунками – 20 шт. 2) Бульон для разведения (флакон стеклянный 3 мл)- 20 шт. 3) Реагент Гемолизин для теста на гемолитическую активность (флакон стеклянный 5 мл)- 1 шт. Состав набора: 1) Стрипы с лунками – 20 шт. 2) Бульон для разведения (флакон стеклянный 3 мл)- 20 шт. 3) Реагент Гемолизин для теста на гемолитическую активность (флакон стеклянный 5 мл)- 1 шт.

63

64 Применение: используется для видовой идентификации чистой культуры листерий Применение: используется для видовой идентификации чистой культуры листерий Отбирается отдельная колония, суспендируется в бульоне, раскапывается в лунки Отбирается отдельная колония, суспендируется в бульоне, раскапывается в лунки После инкубации ч. считывается результат- вид микроорганизма После инкубации ч. считывается результат- вид микроорганизма Определяемые виды Определяемые виды Listeria monocytogenes Listeria monocytogenes Listeria ivanovii Listeria ivanovii Listeria seeligeri Listeria grayi Listeria innocua Listeria welshimeri Listeria seeligeri Listeria grayi Listeria innocua Listeria welshimeri

65

66

67

68

69 Ингредиенты грамм/литр Пептически й перевар животной ткани 23,00Крахмал 1,00Натрия хлорид 5,00D-Маннит 10,00Железа аммонийного цитрат 0,50Эскулин 0,80 Глюкоза 0,50 Лит ия хлорид 15,00 Феноловый красный 0,08 Агар-агар 13,00 Конечное значение рН (при 25°С) 7,0 ± 0,2 Ингредиенты грамм/литр Пептически й перевар животной ткани 23,00Крахмал 1,00Натрия хлорид 5,00D-Маннит 10,00Железа аммонийного цитрат 0,50Эскулин 0,80 Глюкоза 0,50 Лит ия хлорид 15,00 Феноловый красный 0,08 Агар-агар 13,00 Конечное значение рН (при 25°С) 7,0 ± 0,2

70 Размешать 69,0 г порошка в 1000 мл дистиллированной воды. Прокипятить до полного растворения среды. Стерилизовать автоклавированием при 1 атм (121°С) в течение 15 мин. Остудить до 500С и асептикески внести растворенное в воде содержимое 2 флаконов с селективной добавкой (PALCAM) для листерий. Тщательно перемешать и разлить среду в стерильные чашки Петри. Размешать 69,0 г порошка в 1000 мл дистиллированной воды. Прокипятить до полного растворения среды. Стерилизовать автоклавированием при 1 атм (121°С) в течение 15 мин. Остудить до 500С и асептикески внести растворенное в воде содержимое 2 флаконов с селективной добавкой (PALCAM) для листерий. Тщательно перемешать и разлить среду в стерильные чашки Петри. ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ: хлорид лития ядовит. Избегать прикосновения и вдыхания паров. При попадании на кожу немедленно смыть большим количеством воды. ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ: хлорид лития ядовит. Избегать прикосновения и вдыхания паров. При попадании на кожу немедленно смыть большим количеством воды. Среда является высоко селективной ввиду наличия в ней хлорида лития, цефтазидима, полимиксина В и акрифлавина. PALCAM агар - дифференциально-диагностическая среда, в которой используются 2 индикаторные системы: с эскулином и маннитом. Среда является высоко селективной ввиду наличия в ней хлорида лития, цефтазидима, полимиксина В и акрифлавина. PALCAM агар - дифференциально-диагностическая среда, в которой используются 2 индикаторные системы: с эскулином и маннитом. Listeria monocytogenes гидролизует эскулин на эскулетин и глюкозу. Реагируя с цитратом железа, эскулетин образует коричнево-черный комплекс, что приводит к потемнению среды вокруг колоний. Листерии не ферментируют маннит, поэтому сбраживающие маннит энтерококки и стафилококки формируют цветные колонии (от красного до желтого). Микроаэрофильные условия ограничивают рост аэробов, подобных представителям родов Bacillus и Pseudomonas. Listeria monocytogenes гидролизует эскулин на эскулетин и глюкозу. Реагируя с цитратом железа, эскулетин образует коричнево-черный комплекс, что приводит к потемнению среды вокруг колоний. Листерии не ферментируют маннит, поэтому сбраживающие маннит энтерококки и стафилококки формируют цветные колонии (от красного до желтого). Микроаэрофильные условия ограничивают рост аэробов, подобных представителям родов Bacillus и Pseudomonas. Введение в состав среды яичного желтка (2,5%) способствует восстановлению поврежденных клеток. Добавление среды с кровью поверх PALCAM агара позволяет дифференцировать и подсчитать количество гемолитических листерий. Введение в состав среды яичного желтка (2,5%) способствует восстановлению поврежденных клеток. Добавление среды с кровью поверх PALCAM агара позволяет дифференцировать и подсчитать количество гемолитических листерий. В зависимости от типа анализируемой пробы перед высевом на PALCAM агар должно быть проведено обогащение в том или ином бульоне для селективного обогащения. В зависимости от типа анализируемой пробы перед высевом на PALCAM агар должно быть проведено обогащение в том или ином бульоне для селективного обогащения.

71 Контроль качества: Контроль качества: Внешний вид порошка: Гомогенный сыпучий светло-розовый порошок. Внешний вид порошка: Гомогенный сыпучий светло-розовый порошок. Плотность готовой среды: Образуется среда, соответствующая по плотности 1,3% агаровому гелю. Плотность готовой среды: Образуется среда, соответствующая по плотности 1,3% агаровому гелю. Цвет и прозрачность готовой среды: Готовая среда имеет красную окраску, прозрачна, со слегка опалесцирующей поверхностью. Цвет и прозрачность готовой среды: Готовая среда имеет красную окраску, прозрачна, со слегка опалесцирующей поверхностью. Кислотность среды: При 25°С водный раствор (6,9 % вес/об) имеет рН 7,0 ± 0,2. Кислотность среды: При 25°С водный раствор (6,9 % вес/об) имеет рН 7,0 ± 0,2.

72

73 Триптозно-фосфатный бульон с полимиксином В Триптозно-фосфатный бульон с полимиксином В (Бойсен-Мюллер) (Бойсен-Мюллер) Триптоза 20.0 мг Декстроза 2.0 г Хлорид натрия 5.0 г Динатрий фосфат 2.5 г Дистиллированная вода мл Добавьте ингредиенты к воде. Размешайте. Когда раствориться, доведите рН до 7.3. Стерилизуйте автоклавированием при +121°С в течение 15 мин. Охладите и добавьте 5.0 г стерильной тиамин-HCl и 3.12 мг полимиксина В к 1 л ТРВ. Перемешайте Триптоза 20.0 мг Декстроза 2.0 г Хлорид натрия 5.0 г Динатрий фосфат 2.5 г Дистиллированная вода мл Добавьте ингредиенты к воде. Размешайте. Когда раствориться, доведите рН до 7.3. Стерилизуйте автоклавированием при +121°С в течение 15 мин. Охладите и добавьте 5.0 г стерильной тиамин-HCl и 3.12 мг полимиксина В к 1 л ТРВ. Перемешайте

74 . К 1 л расплавленного МПА (рН ) перед разливом добавляют 10 мл 2%-го водно- глицеринавого раствора теллурита калия и мл раствора флоримицина или полимиксина (500 тыс. ед. препарата разводят в 10 мл физиологического раствора). К 1 л расплавленного МПА (рН ) перед разливом добавляют 10 мл 2%-го водно- глицеринавого раствора теллурита калия и мл раствора флоримицина или полимиксина (500 тыс. ед. препарата разводят в 10 мл физиологического раствора). Цвет колонии на среде с теллуритом калия черный. Цвет колонии на среде с теллуритом калия черный.

75 Триптозно-фосфатный бульон (ТРВ). Триптозно-фосфатный бульон (ТРВ). Триптоза 20.0 мг Декстроза 2.0 г Хлорид натрия 5.0 г Динатрий фосфат 2.5 г Дистиллированная вода мл Добавьте ингредиенты к воде. Хорошо смешайте. Когда раствориться, доведите рН до 7.3. Разлейте и стерилизуйте автоклавированием при +121°С в течение 15 мин. Триптоза 20.0 мг Декстроза 2.0 г Хлорид натрия 5.0 г Динатрий фосфат 2.5 г Дистиллированная вода мл Добавьте ингредиенты к воде. Хорошо смешайте. Когда раствориться, доведите рН до 7.3. Разлейте и стерилизуйте автоклавированием при +121°С в течение 15 мин.

76 Для выделения листерий из клинического материала и продуктов питания используют селективные факторы. Наибольшее значение имеют температурный фактор и селективные добавки [3, 35, 37]. Для выделения листерий из клинического материала и продуктов питания используют селективные факторы. Наибольшее значение имеют температурный фактор и селективные добавки [3, 35, 37] Метод холодового обогащения при температуре +4oС, основанный на психрофильности листерий, весьма эффективен, но из-за длительных сроков инкубации (10-60 дней) не может быть рекомендован для клинической диагностики. В современных схемах выделения листерий обычно используют инкубацию при температуре 30oС в течение ч в бульоне с селективными добавками для обогащения исследуемого образца. Метод холодового обогащения при температуре +4oС, основанный на психрофильности листерий, весьма эффективен, но из-за длительных сроков инкубации (10-60 дней) не может быть рекомендован для клинической диагностики. В современных схемах выделения листерий обычно используют инкубацию при температуре 30oС в течение ч в бульоне с селективными добавками для обогащения исследуемого образца.

77 В качестве сред обогащения обычно используют различные варианты триптиказо-соевого бульона с дрожжевым экстратом и селективными компонентами - хлорид лития, акрифлавин (0,02-0,01 г/л), налидиксовую кислоту (0,05-0,01 г/л) и циклогексимид (0,05-0,01 г/л) или полимиксин В ( ЕД) и др. В качестве сред обогащения обычно используют различные варианты триптиказо-соевого бульона с дрожжевым экстратом и селективными компонентами - хлорид лития, акрифлавин (0,02-0,01 г/л), налидиксовую кислоту (0,05-0,01 г/л) и циклогексимид (0,05-0,01 г/л) или полимиксин В ( ЕД) и др. Бульон Фрезера Бульон Фрезера

78 Oxoid Chromogenic Listeria Agar (OCLA) detects the β-glucosidase activity common to all Listeria species resulting in distinct blue colonies. detects phosphatidycholine phospholipase produced by pathogenic Listeria species,results visible white halo around pathogenic Listeria colonies.