Выделение и химическая структура силенана – пектина смолевки обыкновенной Silene vulgaris Бушнева О.А. акад., д.х.н. Оводов Ю.С., ст.н.с., к.х.н. Оводова. - презентация

1 Выделение и химическая структура силенана – пектина смолевки обыкновенной Silene vulgaris Бушнева О.А. акад., д.х.н. Оводов Ю.С., ст.н.с., к.х.н. Оводова Р.Г. Научные руководители :

2 Цель работы: 1.Получение пектинового полисахарида из надземной части смолевки обыкновенной Silene vulgaris (Moench) Garke (Oberna behen (L.) Ikonn) 2.Разработка эффективного способа выделения пектиновых полисахаридов из надземной части цветковых растений на примере смолевки обыкновенной 3.Установление общих закономерностей распределения углеводных цепей и особенностей тонкой структуры пектинового полисахарида из смолевки обыкновенной

3 свежесобранная надземная часть смолевки обыкновенной остаток сырья фильтрат фильтрат объединенныйэкстракт обработка 0.5% р-ром формальдегида (12 ч., 20°С) и фильтрование обработка подкисленной водой (рН 4.0, 3 ч., 50°С), фильтрование отход 1. концентрирование 2. осаждение спиртом 2. осаждение спиртом 3. диализ 4. лиофилизация 3. диализ 4. лиофилизация силенан экстракция 0.7%-ным оксалатом аммония (6ч. х 2, 68°С ), фильтрование слив Рис. 1.

4 Выход и состав образцов SV из различных образцов S. vulgaris Образцы силенана Выход, % 1 Содержание, % Gal A 2 ОМе 2 Нейтральные моносахариды 3 Белок 2 Rha RhaGalAraXylManGlc SV 1 SV 2 SV 3 SV 4 SV SV SV выход от сухого сырья; 2 - в весовых процентах; 3 – в мольных процентах Сбор образцов по фазам вегетации интродуцированной S. vulgaris: SV1 - появление надземной части, SV2 - бутонизация, SV3 - начало цветения, SV4 - массовое цветение, SV5 – конец цветения и начало созревания семян, SV6 - созревание семян; и SV7 - из дикорастущей S. vulgaris в фазу цветения. Рис. 2.

5 объединенный экстракт 1. концентрирование 1. концентрирование 2. осаждение спиртом 2. осаждение спиртом 3. диализ 3. диализ 4. лиофилизация 4. лиофилизация выход 2.2%, 78 % D-GalpA, 3.0 % ОМе [ ] D 20 = (с 0.08; вода) 3.7 % Ara, 3.3 % Gal, 1.8 % Rha, 9 % белок SV 8 силенанSV 5. гельфильтрация 1. ультрафильтрация Мw 100 кДа Мw 100 кДа 2. лиофилизация 2. лиофилизация SV 9 выход 2.2%, 80 % D-GalpA, 4.2 % ОМе [ ] D (с 0.06; вода) 3.4 % Ara, 2.2 % Gal, 1.7 % Rha, 10 % белок Рис. 3.

6 СИЛЕНАН SV [ ] 25 = 120 г/см 3, M sD = 22 кДа, 1.15% золы SV - 3 выход 19% и онообменная хроматографи я на DEAE-целлюлозе 43 % D-GalpA, 5.4 % Ara, 6.4 % Gal, 2.1 % Rha SV - 2 выход 10% SV - 1 выход 7% 0. 1 M Na С l 0.2 M Na С l 0. 3 M Na С l 70 % D-GalpA, 4.1 % Ara, 4.4 % Gal, 2.0 % Rha 85 % D-GalpA, 2.3 % Ara, 2.1 % Gal, 1.5 % Rha Рис. 4.

7 СИЛЕНАН SV частичный кислотный гидролиз ферментативный гидролиз пектиназой распад по Смиту литий-деградация SVH SVP и SVP-P SVP-S ГЖХЯМР ГЖХ - МС SVP-L Рис. 5.

8 СИЛЕНАН SV частичный кислотный гидролиз (0.05 М TFA, 24 ч., 50°С) SVH K av = 0, выход 45 % 94 % D-GalpA, 2. 7 % О М е, Rha сл. ЯМР гельфильтрация на S-500 [ ] D 20 = [ ] D 20 = (с 0. 1 ; вода) (с 0. 1 ; вода) галактуронан(рамногалактуронан) Рис. 6. Схема частичного кислотного гидролиза SV

9 Спектр 13 С-ЯМР фрагмента SVH Рис. 7. Спектр 13 С-ЯМР фрагмента SVH C1 -1,4- D-GalpA C6 -1,4- D-GalpA C4 -1,4- D-GalpA C5 -1,4- D-GalpA C2 -1,4- D-GalpA C3 -1,4- D-GalpA

10 Главная углеводная цепь линейной области силенана SV: … 4)- -D-GalpA-(1 4)- -D-GalpA-(1 n 4)- -D-GalpA-(1 … Рис.8.

11 СИЛЕНАН SV SVP K av = 0, выход 13 % гельфильтрация на S-500 на S-500 омыление 0.5 М NaOH ферментативный гидролиз пектиназой гельфильтрация на Р-4 SVP-P K av = 0.02, выход 6% ферментативный гидролиз пектиназой омыление 0.5 М NaOH ферментативный гидролиз пектиназой SVP-1 K av = 0, выход 7% гельфильтрация на Р-4 GalpA Схема ферментативного гидролиза SV Рис. 9. Схема ферментативного гидролиза SV

12 44 % 3.1% 4.3 % 9.3 % 7.8 % SVP SVP-1 SVP-P [ ] D 20 = (с 0. 1 ; вода) [ ] D 20 = (с 0. 1 ; вода) [ ] D 20 = (с 0. 1 ; вода) 32 % 0% 15.1 % 25.6 % 11.9 % 35 % 0% 15.8 % 22.1 % 12.1 % GalA МеО Ara Gal Rha ЯМР Рис. 10.

13 Рис. 11. Спектр 13 С-ЯМР фрагмента SVР-P C1 -1,4- D-GalpA Rhap CH3 C1 Rhap

14 Рис. 12. Спектр 1 Н/ 13 С HSQC фрагмента SVР-P 2)- -Rhap-(1 2)- -Rhap-(1 4)4)4)4)

15 Рис. 13. Спектр 1 Н/ 13 С HSQC фрагмента SVР -Galp-(1 3)- -Galp-(1 … -Galp-(1 3)- -Galp-(1 … -Galp-(1 4)- -Galp-(1 … -Galp-(1 4)- -Galp-(1 … -Araf-(1 5)- -Araf-(1 … -Araf-(1 5)- -Araf-(1 …

16 Линейный галактуронан: … 4)- -D-GalpA-(1 4)- -D-GalpA-(1 n 4)- -D-GalpA-(1 … -Araf-(1 5)- -Araf-(1 … -Araf-(1 5)- -Araf-(1 … -Galp-(1 4)- -Galp-(1 … -Galp-(1 4)- -Galp-(1 … -Galp-(1 3)- -Galp-(1 … -Galp-(1 3)- -Galp-(1 … Боковые цепи (side chains): Рамногалактуроанан I: Кор: 2)- -Rhap-(1 4)- -GalpA-(1 n 2)- -Rhap-(1 4)- -D-GalpA 2)- -Rhap-(1 4)- -GalpA-(1 n 2)- -Rhap-(1 4)- -D-GalpA 4)4)4)4) s.сh. … 2)- -Rhap-(1 4)- -GalpA-(1 n 2)- -Rhap-(1 4)- -D-GalpA … Линейный рамногалактуронан: Рис )4)4)4)

17 SVP-S K av =0.8, выход 7 % SVP [ ] D 20 = (с 0. 1 ; вода) 44 % D-GalpA, 4.3 % Ara, 9.3 % Gal, 7.8 % Rha [ ] D 20 = (с 0.37; вода) 28 % D-GalpA, 12.9 % Ara, 35.6 % Gal, 5.8 % Rha гельфильтрация на G-25, S-500 ЯМР ГЖХ - МС распад по Смиту Рис. 15. Схема распада по Смиту SVP

18 Рис. 16. Спектр 1 Н/ 13 С HSQC фрагмента SVР-S 3)- -Galp-(1 3)- -Galp-(1 3)- -Galp-(1 3)- -Galp-(1 3)- -Galp-(1 3)- -Galp-(1 2) 2) 5)- -Araf-(1 5)- -Araf-(1 … 5)- -Araf-(1 … 3)- -Galp-(1 C2 2,3)- -Galp-(1 C2 2,3)- -Galp-(1 C2 3)- -Galp-(1 C2 3)- -Galp-(1

19 Результаты ГЖХ-МС гидролизата перметилированного фрагмента SVP-S Рис. 17. Метилированные сахара Фрагменты 2,3,5-Me 3 -Ara 2,3,5-Me 3 -Ara Araf-(1 Araf-(1 2,3,4,6-Me 4 -Gal Galp-(1 Galp-(1 2,4,6-Me 3 -Gal 2,4,6-Me 3 -Gal 3)-Galp-(1 3)-Galp-(1 2,3,4-Me 3 -Gal 2,3,4-Me 3 -Gal 6)-Galp-(1 6)-Galp-(1 2,4-Me 2 -Gal 2,4-Me 2 -Gal 3,6)-Galp-(1 3,6)-Galp-(1

20 SVP-L-1 K av = 0, выход 10 % SVP смесь олигосахаридов, выход 38 % гельфильтрация на Р-4 ГЖХ - МС SVP-L-2 K av = 0.5, выход 12 % [ ] D 20 = (с ; вода) 2 2 % D-GalpA, 23.4 % Ara, 27.6 % Gal, 11.9 % Rha [ ] D 20 = (с ; вода) 32 % D-GalpA, 35.0 % Ara, 33.0 % Gal, 24.0 % Rha литий-деградация 44 % D-GalpA, 4.3 % Ara, 9.3 % Gal, 7.8 % Rha Рис. 18. Схема литий-деградации SVP

21 Результаты ГЖХ-МС гидролизата перметилированных фрагментов SVP-L-1 и SVP-L-2 Рис. 19. Метилированные сахара Фрагменты 2,3,5-Me 3 -Ara 2,3,5-Me 3 -Ara Araf-(1 Araf-(1 2,3-Me 2 -Ara 2,3-Me 2 -Ara 5)-Araf-(1 5)-Araf-(1 3-Me-Ara 3-Me-Ara 2,5)-Araf-(1 2,5)-Araf-(1 2-Me-Ara 2-Me-Ara 3,5)-Araf-(1 3,5)-Araf-(1 2,3,4,6-Me 4 -Gal Galp-(1 Galp-(1 2,3,6-Me 3 -Gal 2,3,6-Me 3 -Gal 4)-Galp-(1 4)-Galp-(1 2,4,6-Me 3 -Gal 2,4,6-Me 3 -Gal 3)-Galp-(1 3)-Galp-(1 2,3,4-Me 3 -Gal 2,3,4-Me 3 -Gal 6)-Galp-(1 6)-Galp-(1 2,6-Me 2 -Gal 2,6-Me 2 -Gal 3,4)-Galp-(1 3,4)-Galp-(1 2,4-Me 2 -Gal 2,4-Me 2 -Gal 3,6)-Galp-(1 3,6)-Galp-(1 3-ОMe-Rha 3-ОMe-Rha 2,4)-Rhap-(1 2,4)-Rhap-(1

22 Линейные области силенана: … 4)- -D-GalpA-(1 4)- -D-GalpA-(1 n 4)- -D-GalpA-(1 … … 2)- -Rhap-(1 4)- -GalpA-(1 n 2)- -Rhap-(1 4)- -D-GalpA … Разветвленные области силенана: Кор: 2)- -Rhap-(1 4)- -GalpA-(1 n 2)- -Rhap-(1 4)- -D-GalpA 2)- -Rhap-(1 4)- -GalpA-(1 n 2)- -Rhap-(1 4)- -D-GalpA 4)4)4)4) 4)4)4)4) s.ch. s.ch. и s.ch. - side chains (боковые цепи) Рис. 20.

23 3)-Galp-(1 3)-Galp-(1 5)-Araf-(1 5)-Araf-(1 2) 2) 5)-Araf-(1 5)-Araf-(1 3) 3) 3)- -Galp-(1 3)- -Galp-(1 3)- -Galp-(1 3)- -Galp-(1 3)- -Galp-(1 3)- -Galp-(1 2) 2) 5)- -Araf-(1 5)- -Araf-(1 6) Точки разветвления боковых цепей: 4) -Araf-(1 5)- -Araf-(1 … -Araf-(1 5)- -Araf-(1 … -Galp-(1 4)- -Galp-(1 … -Galp-(1 4)- -Galp-(1 … -Galp-(1 3)- -Galp-(1 … -Galp-(1 3)- -Galp-(1 … -Galp-(1 6)- -Galp-(1 … -Galp-(1 6)- -Galp-(1 … Боковые цепи RG-I: и Рис. 21.

24 1.Впервые из надземной части цветкового растения Silene vulgaris (Moench) Garke (Oberna behen (L.) Ikonn) выделен пектиновый полисахарид, названный силенаном. Показано, что в состав углеводной цепи силенана входят остатки галактуроновой кислоты (более 60%), арабинозы, галактозы и рамнозы в качестве основных компонентов. Остатки галактуроновой кислоты имеют низкую степень метоксилирования. 2. Разработан эффективный метод выделения силенана из свежесобранного растительного материала, который позволяет получать пектиновые полисахариды в наиболее нативном состоянии. ВЫВОДЫ

25 3.Показано, что макромолекула силенана состоит из линейных и разветвленных областей. Линейная область представлена -1,4-D- галактопиранозилуронаном и -1,2-рамно- -1,4-D- галактуронаном, который является углеводной цепью разветвленной области силенана – рамногалактуронана I (RG-I). Боковые цепи RG-I присоединены 1,4-связью к остаткам рамнопиранозы кора и представляют собой линейные цепи -1,5-связанной арабинофуранозы и -1,3-, -1,4- и -1,6-галактопиранозы. Точками разветвления являются остатки 2,5-, 3,5- замещенной арабинофуранозы и 2,3-, 3,6-, 3,4- замещенной галактопиранозы.

26 5.В процессе изучения силенана получена принципиально новая дополнительная информация для базы данных по спектроскопии ЯМР пектиновых полисахаридов, которая может быть использована для структурного исследования пектинов из новых растительных источников. 4.Использование классических и современных методов структурной углеводной химии, включая спектроскопию ЯМР, позволило подтвердить наличие ковалентных связей между линейной цепью рамногалактуронана и боковыми углеводными цепями разветвленных областей силенана.

27 Данная работа поддержана грантами РФФИ (Гранты No , ) и «Минпромнауки РФ» (Грант No ). Авторы выражают благодарность д.х.н., проф. А.С. Шашкову (ИОХ им. Н.Д. Зелинского, РАН) за съемку и помощь в расшифровке ЯМР- спектров и к.х.н. А.О. Чижову (ИОХ им. Н.Д. Зелинского, РАН) за съемку и помощь в расшифровке хромато-масс- спектров.

28 Научная новизна : Впервые установлена частичная химическая структура силенана, пектинового полисахарида из надземной части смолевки обыкновенной Silene vulgaris (Moench) Garke. Впервые установлена частичная химическая структура силенана, пектинового полисахарида из надземной части смолевки обыкновенной Silene vulgaris (Moench) Garke. Установлено, что отличительной структурной особенностью силенана является наличие длинных участков линейного - 1,4-D-галактопиранозилуронана. С этой целью, наряду с современными методами структурной химии углеводов, широко использована двумерная гомоядерная спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР).

29 Впервые доказана связь главной и боковых углеводных цепей силенана через остатки рамнопиранозы кора разветвленной области. При этом показано, что боковые цепи разветвленных областей силенана представляют собой блоки, состоящие из различных типов арабиногалактана. Установленная химическая структура силенана не только подтверждает общие закономерности распределения углеводных цепей, но и дает новую информацию об особенностях тонкой структуры пектиновых полисахаридов. Кроме того, впервые показано, что макромолекула силенана содержит фрагменты линейного рамногалактуронана и разветвленной области, представленной рамногалактуронаном I (RG-I).