ЛЕКЦИЯ 4 СТРУКТУРА МИТОХОНДРИАЛЬНОГО ГЕНОМА ГРИБОВ И ЖИВОТНЫХ 1. Митохондриальные ДНК грибов – организация и физико- химические параметры 2. Генетическая. - презентация

1 ЛЕКЦИЯ 4 СТРУКТУРА МИТОХОНДРИАЛЬНОГО ГЕНОМА ГРИБОВ И ЖИВОТНЫХ 1. Митохондриальные ДНК грибов – организация и физико- химические параметры 2. Генетическая карта мтДНК дрожжей 3. Интроны митохондриальных генов дрожжей. 4. Организация митохондриального генома других грибов 5. Генетическая карта мтДНК нейроспоры 6. Митохондриальные плазмиды нейроспоры и их связь со старением штаммов 7. Организация митохондриального генома животных

2 Электронно-микроскопическая фотография дрожжевых клеток с: А нормальными митохондриями В гигантской митохондрией С мутанты без митохондрий А В С Каждая клетка грибов содержит множество митохондрий Выживают только на специальных средах Митохондрия дрожжей, прижизненная окраска флуоресцентным красителем

3 Митохондриальная ДНК, подобно хлоропластной, организована в нуклеоиды Размеры нуклеоидов дрожжей обычно нм Каждый нуклеоид содержит 3-5 молекул мтДНК

4 Слева – почкующаяся дрожжевая зигота, справа в тех же клетках – митохондриальные нуклеоиды Митохондриальные нуклеоиды, подобно хлоропластным, связаны с внутренней мембраной митохондрии В нуклеоидах молекулы ДНК связаны с гистоноподобными белками

5 Грибы – обширная и разнообразная группа, включающая более видов

6 Organism Classification Size(kbp) Shape % Sequenced Status $$$ CHYTRIDIOMYCOTA Allomyces macrogynus Blastocladiales circle 100% P Allomyces arbusculus Blastocladiales 54 circle 15% ** P Catenaria anguillulae (Barr) Blastocladiales 45 ? 3% PCR Spizellomyces punctatus (Barr) Spizellomycetales circles*** 100% Y/P Rhizophlyctis rosea (Barr) Spizellomycetales ~50 circle? 5% PCR P Rhizophydium #136 (Longcore) Chytridiales circle 100% Y/P Harpochytrium #94 (Longcore) Monoblepharidales circle 100% Y/P Harpochytrium #105 (Longcore) Monoblepharidales circle 100% Y/P Hyaloraphidium curvatum Monoblepharidales linear (mon.) 100% P Monoblepharella #15(Mollicone) Monoblepharidales circle 100% Y/P Monoblepharis #20 (Mollicone) Monoblepharidales ~40 circle? 5% PCR ZYGOMYCOTA Rhizopus stolonifer Mucorales circle 100% Y/P(partial) Mucor mucedo Mucorales ? circle? 0.6 kbp (PCR) Mortierella verticillata Mortierellales circle 100% Y Smittium culisetae Harpellales circle 100% Aspergillus nidulans ASCOMYCOTA 32 circle 94% # Galiella rufa ASCOMYCOTA (Pezizales) 30 ? - Saitoella complicata ASCOMYCOTA 43 circle 99% Schizosaccharomyces pombe ASCOMYCOTA circle 100% P Schizosaccharomyces octosporus ASCOMYCOTA circle 100% Y/P Schizosaccharomyces jap.v.jap ASCOMYCOTA ~86 circle 100% Y/P Taphrina deformans ACOMYCOTA circle 100% Cantharellus cibarius BASIDIOMYCOTA circle 100% Schizophyllum commune BASIDIOMYCOTA circle 100% Y/P(partial) Phytophthora infestans OOMYCOTA (pseudofungi) circle 100% Y/P Phytophthora megasperma OOMYCOTA (pseudofungi) ~38 circle 28% * Monosiga brevicollis (Nerad) CHOANOZOA circle 100% Y/P Митохондриальный геном грибов необычайно изменчив по размерам: от до пар оснований, ГЦ состав: от 18% до 36% МБМБ

7 Митохондриальные карты обычно представляют кольцевыми, однако у трети из изученных видов дрожжей и в других группах грибов выявлены линейные молекулы Они имеют терминальные структуры – «митохондриальные теломеры» Теломеры интенсивно изучаются в связи с репликацией линейных мтДНК и другими явлениями: апоптозом, болезнями, инфекциями, «бессмертием» Организация молекул митохондриальной ДНК грибов

8 ГЦ-содержание в мтДНК дрожжей мало – от 18 до 25%. Однако 2-3% генома содержат участки, богатые ГЦ-парами Митохондриальный геном дрожжей Длина ГЦ-кластеров пн, их количество на геном – до 150 и более, расположены они в межгенных участках спейсеры сайт-кластеры гены ГЦ-кластеры ГЦ-пар – 26% ГЦ пар меньше 5% более 50% ГЦ-пар

9 Примеры ГЦ-кластеров в митохондриальной ДНК грибов В мт геноме дрожжей очень часто происходят рекомбинации, в которых участвуют ГЦ-кластеры Следствием аномального рекомбиногенеза являются и мутанты petite, несущие крупные делеции мтДНК

10 Даже у разных видов одного и того же рода Saccharomyces размер молекул мтДНК сильно различается: 85 тпн – «длинный геном» 78 тпн - «короткий» геном» 74 тпн – «сверхкороткий» геном » У примитивного вида дрожжей S.uvarum геном мт всего 57 тпн Но несмотря на разный размер мтДНК, набор кодируемых генов у разных видов рода практически одинаков. Митохондриальная ДНК дрожжей кодирует значительно меньше генов, чем мтДНК растений Митохондриальный геном дрожжей необычайно изменчив по размерам

11 rnl ori4 ori3 var 1 atp9 ori6 cob ori2 ori7 atp6 atp8 cox1 ori8 rns ori1 tsI ori5 cox3 tmtl cox2 Карта митохондриального генома Saccharomyces cerevisiae 8 ori – сайтов - точки начала репликации Стрелки указывают места инициации транскрипции Гены тРНК (24) обозначены точками Черные прямоугольники экзоны, белые – интроны Содержит до 9 интронов

12 Компоненты митохондрийГены рибосомальная РНК rns (21S), rnl (15S) рибосомальные белки: малая субъединица var1 транспортные РНК РНК-компонент РНКаза-P подобного фермента 24 цитохром b (компл. III) cob (или cyb) цитохром c оксидаза (компл.IV) - 3 субъединицы coxI, coxII, coxIII ATФ синтаза - 3 субъединицы atp6, atp 8, atp 9 Интрон-кодируемые orf : РНК-матуразы эндонуклеазы белки подобные обратной транскриптазе (orf cox1 интр.) mat ? aI1, aI2 Неидентифицированные рамки считывания3 Гены митохондриальных ДНК дрожжей

13 Интроны митохондриальных генов дрожжей Число интронов варьирует у разных штаммов Штаммы без интронов так же жизнеспособны, как и с интронами, но - если сплайсинг нарушен, штамм становится нежизнеспособным.. Сайты узнавания интрон-кодируемыми эндонуклеазами очень длинные – до 18 нуклеотидов, они гораздо специфичнее рестриктаз. (рис.) Интроны могут содержать ORF Обычно эти ORF кодируют ферменты: матуразы, эндонуклеазы Сайты узнавания интрон-кодируемыми эндонуклеазами очень длинные – до 18 нуклеотидов, они гораздо специфичнее рестриктаз.

14 Карта митохондриального генома одного из примитивных видов грибов хитридиомицетов

15 Набор генов – типичный для грибов Все гены транскрибируются с одной нити но тРНК – всего 8 генов Карта митохондриального генома еще одного вида хитридиомицетов !!!

16 Митохондриальный геном хитридиомицетов Размер генома очень изменчив: от 19,500 до 60,440 пн тРНК генов очень мало – 7-9, но всегда остаются те же самые ГЦ cостав 36-39% - больше, чем в мтДНК других грибов

17 Митохондриальные карты трех видов зигомицетов Гены кодируются на обеих цепочках; Кодирующие последо- вательности занимают 35-43%; Порядок генов изменчив; У Rhizopus oryzae гены nad2/nad3 и nad4/nad5 перекрываются на 1 нуклеотид; Набор тРНК достаточен.

18 Гены, ORF и интроны в мтДНК зигомицетов HOMEHELPFEEDBAC K SUBSCRI PTIONS ARCHIVESEARCHTABLE OF CONTENT S HOMEHELPFEEDBAC K SUBSCRI PTIONS ARCHIVESEARCHTABLE OF CONTENT S QUICK SEARCH: [advanced] Author:Keyword(s): Year: Vol : Page: Return to article Гены и интроныR.oryzaeM.verticillataS.culisetae rns, rnl аtp 6,8,9 cob, cox1,2,3 nad1-6,4L trnA-W24 [trnI (cau) отсутствует ]2627 rnpB rps3 Интроны группы 19(5)4(3)14(13) Локализация интронов (количество) cox1(3), cox2(1) cox3(1), cob(2) nad3(1), atp9(1) cox1(3), cox3(1) rnl(1), cox1(9) cox2(1), cob(3) Другие ORFs473 Return to article Общее число генов – более 40

19 Геном очень плотно «упакован» 25 генов тРНК 10 других генов 2 промотора Карта митохондриального генома одного из аскомицетов

20 Нейроспора – представитель высших грибов аскомицетов

21 Митохондриальный геном Neurospora – кольцевая молекула размером 62 тпн тРНК генов – 27 3 рРНК гена 7 генов ND 12 других генов У нейроспоры генов мтДНК больше, чем у дрожжей Всего 49 генов

22 Митохондриальные плазмиды Neurospora найдены в природных штаммах промотер ген ДНК- полимеразы ген обратной транскриптазы промотер? промотер ген ДНК- полимеразы ген обратной транскриптазы VS ДНК 881 п.н. Fiji 5268 п.н. LaBelle 4070 п.н. Mauriceville 3581 п.н. Varkud 3675 п.н. ген ДНК- kalilo ген РНК- полимеразы 8643 п.н. полимеразы ген ДНК- maranhar ген РНК- полимеразы п.н полимеразы Терминальный инвертир. повтор Терминальный инвертир. повтор Гипотеза: плазмиды грибов родственны интронам мтДНК и мобильным генетическим элементам

23 Разнообразие типов плазмид у грибов и кодируемых ими генов К настоящему времени плазмиды в митохондриях найдены у 16 видов живых организмов, из них 9 - грибы ДНК-зависимая ДНК-полимераза ДНК-зависимая РНК-полимераза РНК-зависимая РНК-полимераза РНК-зависимая ДНК-полимераза, или обратная транскриптаза

24 Большинство штаммов нейроспоры и других грибов не стареют и кажутся бессмертными Однако описано несколько случаев старения, связанных с линейными плазмидами Штамм N.intermedia Ювенильная стадия: плазмиды существуют в митохондриях в большом количестве копий Начало старения: молекулы ДНК плазмиды kalilo внедряются в мтДНК нейроспоры Механизмом такого старения является, возможно, инактивация генов, связанная с интеграцией плазмид в геном митохондрий

25 Молекула мтДНК имеет структуру: А-В-С- - -L-M-N Молекула мтДНК со встроенной плазмидой имеет структуру: D-E-F-G-kal- G-F-E-D и, возможно, L-M-N-kal-N-M-K. По такому же принципу внедряются в мтДНК плазмиды maranhar, вызывая нарушение работы мтДНК и старение штамма Схема встраивания плазмиды в молекулу митохондриальной ДНК нейроспоры

26 Модель подавления митохондрий после встраивания плазмиды в мтДНК нейроспор. Темными кружками отмечены митохондрии, содержащие встроившиеся плазмиды Молодой штамм Старый штамм

27 Итак, митохондриальные ДНК грибов отличаются от митохондриальных ДНК растений низким процентом ГЦ-пар меньшим размером меньшим числом генов чрезвычайным разнообразием размера молекулы число кодируемых генов варьирует примерно от 25 до 50

28 Из 1283 полностью секвенированных геномов митохондрий более 1100 – митохондриальные ДНК животных простейшие растения животные простейшие

29 Online ISSN Print ISSN Copyright ©Copyright © 2006 Oxford University Press Oxford Journals Oxford University Press Site Map Privacy Policy Frequently Asked Questions Other Oxford University Press sites: Return to article Накопление данных по секвенированным геномам за последние 25 лет Митохондриальные сиквенсы: 2000 г.- 90; 2006 г

30 Митохондриальные ДНК животных Тип / класс Размер генома, т.п.н. Sarcophyton glaucum Cnidaria/Anthozoa (коралл) Ascaris suum нематоды Strongylocentrotus purpuratus иглокожие Drosophila melanogaster членистоногие/ насекомые Xenopus laevis хордовые/ земноводные Cnemidophorus exsanguis хордовые/ пресмыкающ (22.2) Gallus gallus domest. хордовые / птицы Mus musculus хордовые /млекопитающие Homo sapiens хордовые /млекопитающие16.569

31 Bos taurus 16338п.н. Mus musculus Rattus norvegicus Balaenoptera physalus Balaenoptera musculus Phoca vitulina Halichoerus grypus Equus caballus Didelphis virginiana Homo sapiens 16569п.н. Mammalia мтДНК

32 Митохондрии кардиомиоцитов человека Митохондрии различной формы (указаны стрелками) распределяются среди миофибрилл

33 Митохондриальные геномы животных значительно уступают по размерам митохондриальной ДНК большинства грибов и особенно мтДНК растений Митохондриальная ДНК животных представляет собой замкнутую кольцевую молекулу размером от 14 до 42 тысяч пар нуклеотидов, чаще всего т.п.н. Митохондриальные геномы животных даже самых отдаленных филогенетических групп весьма сходны

34 ND 5 ND 4 ATPase6 COIII COII K D COI ND2 I M ND1 L V 16S rRNA 12S rRNA F D-петля QA QA N C S Митохондриальная ДНК птиц ( Gallus gallus) T LSHLSH G ND3 R ND 4L Cyt b E ND6 P ATPase8 ND2 ATPase6 COIII COII K D COI O L I M ND1 L V 16S rRNA 12S rRNA F D-петля OHOH QA QA N C S Митохондриальная ДНК млекопитающих и земноводных (X.laevis) Cyt b T P E ND6 ND 5 LSHLSH G ND3 R ND 4L ND 4 ATPase8 Сравнительная организация митохондриального генома различных классов позвоночных Гены мтДНК животных имеют «уплотненную» организацию Межгенные спейсеры – 1-9 нуклеотидов Гены могут перекрываться на 2-9 нуклеотидов Многие гены расположены встык

35 Гены митохондриальных ДНК животных Компоненты митохондрийГены рибосомальная РНКrns (16S), rnl (12S) транспортные РНК22 цитохром b (компл. III)cyt b цитохром c оксидаза (компл.IV)coxI, coxII, coxIII ATФ-синтазаatp6, atp 8 дыхательная цепь NADH дегидрогеназыnd1,nd2,nd3, nd4l, nd4, nd5, nd6 ИТОГО – 37 генов

36 Увеличение размеров митохондриальных геномов некоторых животных обычно происходит за счет некодирующих повторяющихся последовательностей, почти всегда в контрольной области ND2 ATP6 COIII COII K D COI O L I M ND1 L(UUR) V 16S rRNA 12S rRNA F D-петля OHOH CYTb T P E ND6 ND 5 L(CUN) S (AGY) H G R ND 4 ATP8 W ND3 ND4L LSP HSP 1 ANCYANCY Q S(UCN) 1/ HSP 2 Даже у весьма далеких от позвоночных полухордовых животных Balanoglossus carnosus порядок взаимного расположения генов в целом такой же, как у млекопитающих, т.е. сохраняется в течение 600 млн. лет

37 Ribosomal RNAs Prokaryotes Eukaryotes (mammalian) Mitochondria Large rRNA 2900 nt / 23 S 4800 nt / 28 S 1600 nt / 16 S Small rRNA 1540 nt / 16 S 1900 nt / 18 S 950 nt / 12 S 5.8 S 160 nt / 5.8 S 5 S 120 nt / 5 S 120 nt / 5 S 120 nt / 5 S

38 2 гена рибосомальной РНК в мтДНК животных: 12S и16S – расположены всегда рядом, между ними – ген лейциновой тРНК 22 гена тРНК - достаточно для синтеза всех белков Некоторые тРНК гены образуют кластеры, но основная часть – по одному между белок-кодирующими генами Наиболее консервативен у позвоночных ген тРНК Met, наименее – ген тРНК Ser(AGY), который у млекопитающих, птиц и земноводных имеет необычную структуру с очень короткой DHU петлей Рекомбинации мтДНК животных либо не происходят вообще, либо происходят исключительно редко Особенности организации митохондриальной ДНК животных

39 Гены белков митохондрий 13 генов мтДНК животных кодируют некоторые субъединичные белки пяти компонентов дыхательного комплекса cyt c Межмем- бранное пространство внутренняя мембрана матрикс I III V IV II CoQ NADH NAD + сукци- фума- нат рат H + H + H + H + O 2 2H 2 O APD+P i ATP В исключительно редких случаях отсутствует какой-то из генов в мтДНК некоторых видов или, наоборот, имеются дополнительные гены или генные копии

40 Митохондриальный геном резко редуцирован у паразитических животных Значительно отличаются по организации митохондриальные геномы нематод: ген atp8 отсутствует, гены меньше по размерам, изменен порядок расположения генов, тРНК имеют необычную структуру

41 Самый необычный геном - у картофельной нематоды Globodera pallida: мтДНК - отдельные малые кольцевые молекулы различного размера и с разным набором генов, что является уникальным для многоклеточных животных. Митохондриальный геном другого класса нематод – трихинелл – является промежуточным по организации между обычным мт геномом и мтДНК Globodera. Globodera pallida Trichinella spiralis

42 Итак, митохондриальные ДНК животных- это кольцевые молекулы, которые отличаются чрезвычайно малым размером (16-17 тпн), практически постоянным числом и набором генов – 37, порядок расположения которых относительно друг друга тоже достаточно консервативен. Гены кодируются на обеих цепочках, нередко перекрываясь Единственная некодирующая область генома, так называемая D-петля, содержит точки начала репликации и транскрипции ДНК-молекулы

43 КОНЕЦ ЛЕКЦИИ 4

44

45 Figure 4.4 (A) Electron micrograph showing a thin section through Leishmania tarentolae. The basal body and axoneme extend to the left. (B) Kinetoplast DNA. The maxi circle and many minicircles appear associated in an aggregate. (C) Higher magnifi cation view of many minicircles in various toplogical linkages. (Photographs provided by L. Simpson, UCLA.)