ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ СОВРЕМЕННЫХ МЕТОДОВ МИКРОСКОПИИ, ИСПОЛЬЗУЕМЫХ В БИОЛОГИИ Авторы- составители: Надеждин С.В., Федорова М.З., Головко С.И. Митоз. - презентация

1 ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ СОВРЕМЕННЫХ МЕТОДОВ МИКРОСКОПИИ, ИСПОЛЬЗУЕМЫХ В БИОЛОГИИ Авторы- составители: Надеждин С.В., Федорова М.З., Головко С.И. Митоз

2 Современные методы микроскопии являются важной методологической и методической базой биологических исследований, позволяющей комплексно подойти к расшифровке механизмов клеточных реакций с учетом молекулярных изменений. Теоретические основы электронной, зондовой сканирующей, конфокальной лазерной сканирующей микроскопии являются фундаментом для планирования и реализации экспериментальных работ на живых системах микроуровня. Содержание дисциплины и объем материала, рассматриваемого в лекционном курсе и на семинарских занятиях, призваны познакомить магистрантов, как будущих научных работников, с принципами работы и устройством современных микроскопов. Основное внимание в предлагаемой дисциплине уделяется особенностям использования современной микроскопической техники для изучения биологических объектов. Рассматриваются вопросы подготовки цитологических препаратов для каждого метода микроскопии. Современные методы микроскопии являются важной методологической и методической базой биологических исследований, позволяющей комплексно подойти к расшифровке механизмов клеточных реакций с учетом молекулярных изменений. Теоретические основы электронной, зондовой сканирующей, конфокальной лазерной сканирующей микроскопии являются фундаментом для планирования и реализации экспериментальных работ на живых системах микроуровня. Содержание дисциплины и объем материала, рассматриваемого в лекционном курсе и на семинарских занятиях, призваны познакомить магистрантов, как будущих научных работников, с принципами работы и устройством современных микроскопов. Основное внимание в предлагаемой дисциплине уделяется особенностям использования современной микроскопической техники для изучения биологических объектов. Рассматриваются вопросы подготовки цитологических препаратов для каждого метода микроскопии.

3 Основной целью курса является формирование у магистров системы знаний по теоретическим основам современных методов микросмкопии и перспективах их использования для изучения живых микросистем. Основной целью курса является формирование у магистров системы знаний по теоретическим основам современных методов микросмкопии и перспективах их использования для изучения живых микросистем. Задачи курса формирование знаний по основам устройства и принципа работы современных электронных, сканирующих зондовых и оптических микроскопов; формирование знаний по основам устройства и принципа работы современных электронных, сканирующих зондовых и оптических микроскопов; изучение результатов новейших исследований в биологии, выполненных на основе методов зондовой и конфокальной микроскопии; изучение результатов новейших исследований в биологии, выполненных на основе методов зондовой и конфокальной микроскопии; выбор адекватных методов для выполнения диссертационных работ. выбор адекватных методов для выполнения диссертационных работ.

4 Развитие знаний о морфофункциональных особенностях клеток теснейшим образом связано с успехами микроскопии и применением новых методических подходов. На сегодняшний день основными методами изучения организации биологических микрообъектов являются оптическая (А), электронная (Б) и сканирующая зондовая микроскопия (В). АБ Б В

5 Содержание дисциплины ОПТИЧЕСКАЯ МИКРОСКОПИЯ. Оптическая микроскопия как метод изучения биологических объектов. Принципы формирования изображения в современных оптических микроскопах. Типы и виды оптических микроскопов. Микроскопы проходящего света. Конструктивные части микроскопа проходящего света. Модели современных микроскопов проходящего света. Основные методы исследования, используемые для изучения биологических объектов (светлое поле, темное поле и фазовый контраст, дифференциальный интерференционный контраст, поляризационный контраст, флуоресценция). Микроскопы проходящего света. Конструктивные части микроскопа проходящего света. Модели современных микроскопов проходящего света. Основные методы исследования, используемые для изучения биологических объектов (светлое поле, темное поле и фазовый контраст, дифференциальный интерференционный контраст, поляризационный контраст, флуоресценция). Стереоскопические микроскопы. Основные оптические характеристики. Принципы формирования изображения. Применение для изучения биологических объектов. Стереоскопические микроскопы. Основные оптические характеристики. Принципы формирования изображения. Применение для изучения биологических объектов.

6 Изготовление препаратов для световой микроскопии. Подготовка материала для временных и постоянных препаратов. Фиксация, основные фиксаторы. Окрашивание, характеристика наиболее распространенных красителей. Приготовление микротомных препаратов. Изготовление препаратов для световой микроскопии. Подготовка материала для временных и постоянных препаратов. Фиксация, основные фиксаторы. Окрашивание, характеристика наиболее распространенных красителей. Приготовление микротомных препаратов. микротом Мышь в проходящем свете (продольный разрез).

7 Конфокальная лазерная сканирую- щая микроскопия (КЛСМ). Общая характеристика принципов конфокальной микроскопии. Получение трехмерного изображения в конфокальной микроскопии. Основные методы, используемые в КЛСМ: иммуноцитохимия, трассирование, формирование изображения, флуоресцентные белки, передача энергии посредством флуоресцентного резонанса, восстановление флуоресценции после фотовыжигания, Визуализация времени жизни во флуоресцирующем состоянии, флуоресцентная корреляционная спектроскопия, флуоресцентная in situ гибридизации. Конфокальная лазерная сканирую- щая микроскопия (КЛСМ). Общая характеристика принципов конфокальной микроскопии. Получение трехмерного изображения в конфокальной микроскопии. Основные методы, используемые в КЛСМ: иммуноцитохимия, трассирование, формирование изображения, флуоресцентные белки, передача энергии посредством флуоресцентного резонанса, восстановление флуоресценции после фотовыжигания, Визуализация времени жизни во флуоресцирующем состоянии, флуоресцентная корреляционная спектроскопия, флуоресцентная in situ гибридизации. Клетки Хела

8 ЭЛЕКТРОННАЯ МИКРОСКОПИЯ. Теоретические основы электронной микроскопии. Основные классы электронных микроскопов (просвечивающие и сканирующие) и принципы их работы. Просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ). Устройство просвечивающих электронных микроскопов: источники электронов, электронные линзы, вакуумная система, держатель образцов. Подготовка препаратов для ПЭМ ( фиксация, заливка, ультрамикротомия, монтаж срезов, фотографирование изображений). Устройство ультрамикротомов. Просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ). Устройство просвечивающих электронных микроскопов: источники электронов, электронные линзы, вакуумная система, держатель образцов. Подготовка препаратов для ПЭМ ( фиксация, заливка, ультрамикротомия, монтаж срезов, фотографирование изображений). Устройство ультрамикротомов. Алмазные ножи ультрамикротом

9 Растровая (сканирующая) электронная микроскопия (РЭМ). Принципы работы РЭМ. Методы получения увеличенного изображения. Этапы подготовки биологических объектов к РЭМ (первичная обработка, фиксация и обезвоживание, высушивание, напыление). Растровая (сканирующая) электронная микроскопия (РЭМ). Принципы работы РЭМ. Методы получения увеличенного изображения. Этапы подготовки биологических объектов к РЭМ (первичная обработка, фиксация и обезвоживание, высушивание, напыление). лейкоцит

10 АНАЛИТИЧЕСКАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ МИКРОСКОПИЯ. Приставки рентгеновского спектрального анализа, используемые для изучения локализации и количественной оценки элементов в клетке и субклеточных структурах. Физические основы работы спектрометров. Преимущества рентгеновского микроанализа по сравнению с другими методами. Подготовка образцов для рентгеновского микроанализа. Приставка рентгеновского спектрального анализа

11 СКАНИРУЮЩАЯ ЗОНДОВАЯ МИКРОСКОПИЯ. Принципы работы сканирующих зондовых микроскопов. Атомно-силовой микроскоп (АСМ) как способ изучения биологических объектов. Теоретические основы получения изображения в АСМ. Преимущества АСМ перед другими методами микроскопии. Характеристика основных методом АСМ. АСМ изображение оптическое лейкоцит Сканирующая и оптическая системы АСМ

12 ПРАКТИЧЕСКИЙ БЛОК Семинарское занятие 1 (по главе 1 Оптическая микроскопия, теме 1.1 Микроскоп проходящего света, теме 1.2 Стереоскопические микроскопы). Вопросы для обсуждения на форуме: Методы исследования в оптической микроскопии. Методы исследования в оптической микроскопии. Исследования морфофункциональных особенностей биологических объектов при помощи микроскопов проходящего света и стереоскопических микроскопов. Исследования морфофункциональных особенностей биологических объектов при помощи микроскопов проходящего света и стереоскопических микроскопов. Семинарское занятие 2 (по главе 1 Оптическая микроскопия, теме 1.4 Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия). Вопросы для обсуждения на форуме: Устройство и принцип работы конфокального лазерного сканирующего микроскопа. Устройство и принцип работы конфокального лазерного сканирующего микроскопа. Модификации и модели конфокальных лазерных сканирующих микроскопов. Модификации и модели конфокальных лазерных сканирующих микроскопов.

13 Семинарское занятие 3 (по главе 1 Оптическая микроскопия, теме 1.5 Основные методы, используемые в конфокальной лазерной сканирующей микроскопии). Вопросы для обсуждения на форуме: Иммуноцитохимия и трассирование. Иммуноцитохимия и трассирование. Формирование изображения (Imaging) и «Живые краски» (флуоресцентные белки). Формирование изображения (Imaging) и «Живые краски» (флуоресцентные белки). Передача энергии посредством флуоресцентного резонанса (FRET). Передача энергии посредством флуоресцентного резонанса (FRET). Восстановление флуоресценции после фотовыжигания (FRAP). Восстановление флуоресценции после фотовыжигания (FRAP). Визуализация времени жизни во флуоресцирующем состоянии (FLIM). Визуализация времени жизни во флуоресцирующем состоянии (FLIM). Флуоресцентная корреляционная спектроскопия (FCS). Флуоресцентная корреляционная спектроскопия (FCS). Флуоресцентная in situ гибридизации (FISH). Флуоресцентная in situ гибридизации (FISH). Семинарское занятие 4 (по главе 1 Оптическая микроскопия, теме 1.6 Исследования морфофункциональных особенностей биологических объектов при помощи конфокальной лазерной сканирующей микроскопии). Вопросы для обсуждения на форуме: Исследование клеток. Исследование клеток. Исследование ультраструктур клетки. Исследование ультраструктур клетки. Исследование молекул. Исследование молекул.

14 Семинарское занятие 5 (по главе 2 Электронная микроскопия, теме 2.1 Просвечивающая электронная микроскопия, теме 2.3 Растровая электронная микроскопия). Вопросы для обсуждения на форуме: Устройство и принцип работы просвечивающего электронного микроскопа. Устройство и принцип работы просвечивающего электронного микроскопа. Устройство и принцип работы растрового электронного микроскопа. Устройство и принцип работы растрового электронного микроскопа. Модификации, модели просвечивающих и растровых электронных микроскопов. Модификации, модели просвечивающих и растровых электронных микроскопов. Семинарское занятие 6 (по главе 2 Электронная микроскопия, теме 2.2 Подготовка образцов для просвечивающей электронной микроскопии, теме 2.4 Подготовка образцов для растровой электронной микроскопии, теме 2.5 Исследования морфофункциональных особенностей биологических объектов при помощи электронной микроскопии). Вопросы для обсуждения на форуме: Основные этапы подготовки биологических объектов к просвечивающей электронной микроскопии. Основные этапы подготовки биологических объектов к просвечивающей электронной микроскопии. Оборудование и установки для подготовки биологических объектов к просвечивающей электронной микроскопии. Оборудование и установки для подготовки биологических объектов к просвечивающей электронной микроскопии. Исследование клеток и тканей в растровом электронном микроскопе. Исследование клеток и тканей в растровом электронном микроскопе. Исследование ультраструктур клетки в просвечивающем электронном микроскопе. Исследование ультраструктур клетки в просвечивающем электронном микроскопе.

15 Семинарское занятие 7 (по главе 3 Аналитическая электронная микроскопия, теме 3.1 Спектральный рентгеновский микроанализ, теме 3.2 Подготовка образцов для спектрального рентгеновского микроанализа, теме 3.3 Исследование морфофункциональных особенностей биологических объектов при помощи рентгеновского микроанализа). Вопросы для обсуждения на форуме: Физико-технические основы спектрального рентгеновского микроанализа. Физико-технические основы спектрального рентгеновского микроанализа. Основные этапы подготовки биологических объектов к спектральному рентгеновскому микроанализу. Основные этапы подготовки биологических объектов к спектральному рентгеновскому микроанализу. Изучение локализации и распределения ионов и элементов в биологических объектах. Изучение локализации и распределения ионов и элементов в биологических объектах. Семинарское занятие 8 (по главе 4 Сканирующая зондовая микроскопия, теме 4.1 Атомно-силовая микроскопия, теме 4.2 Методы сканирующей зондовой микроскопии). Вопросы для обсуждения на форуме: Устройство и принцип работы атомно-силового микроскопа. Устройство и принцип работы атомно-силового микроскопа. Контактный метод. Контактный метод. Бесконтактный метод. Бесконтактный метод. «Полуконтактный» метод. «Полуконтактный» метод.

16 Семинарское занятие 9 (по главе 4 Сканирующая зондовая микроскопия, теме 4.3 Факторы, влияющие на качество сканирующей зондовой микроскопии, теме 4.4 Исследования морфофункциональных особенностей биологических объектов при помощи сканирующей зондовой микроскопии). Вопросы для обсуждения на форуме: Основные этапы подготовки биологических объектов к атомно- силовой микроскопии. Основные этапы подготовки биологических объектов к атомно- силовой микроскопии. Факторы и артефакты в сканирующей зондовой микроскопии, качество – изображения. Факторы и артефакты в сканирующей зондовой микроскопии, качество – изображения. Исследование клеток и тканей в атомно-силовом микроскопе. Исследование клеток и тканей в атомно-силовом микроскопе. Исследование ультраструктур клетки в атомно-силовом микроскопе. Исследование ультраструктур клетки в атомно-силовом микроскопе. Исследование молекул. Исследование молекул.

17 Рекомендуемая (основная) литература Рекомендуемая (основная) литература Гоулдстейн Дж., Ньюбери Д., Эчлин П., Джой Д., Фиори Ч., лифшин Э. Растровая электронная микроскопия и рентгеновский микроанализ. М.: Мир, Т.1. – 303 с. Гоулдстейн Дж., Ньюбери Д., Эчлин П., Джой Д., Фиори Ч., лифшин Э. Растровая электронная микроскопия и рентгеновский микроанализ. М.: Мир, Т.1. – 303 с. Гоулдстейн Дж., Ньюбери Д., Эчлин П., Джой Д., Фиори Ч., лифшин Э. Растровая электронная микроскопия и рентгеновский микроанализ. М.: Мир, Т.2. – 348 с. Гоулдстейн Дж., Ньюбери Д., Эчлин П., Джой Д., Фиори Ч., лифшин Э. Растровая электронная микроскопия и рентгеновский микроанализ. М.: Мир, Т.2. – 348 с. Егорова О.В. Техническая микроскопия. М.: Техносфера, – 360 с. Егорова О.В. Техническая микроскопия. М.: Техносфера, – 360 с. Кларк Э. Р., Эберхардт К.Н. Микроскопические методы исследования материалов. М.: Техносфера, – 376 с. Кларк Э. Р., Эберхардт К.Н. Микроскопические методы исследования материалов. М.: Техносфера, – 376 с. Миронов А.А., Комиссарчик Я.Ю., Миронов В.А. Методы электронной микроскопии в биологии и медицине: Методическое руководство. – СПб.: Наука, – 400 с. Миронов А.А., Комиссарчик Я.Ю., Миронов В.А. Методы электронной микроскопии в биологии и медицине: Методическое руководство. – СПб.: Наука, – 400 с. Миронов В.Л. Основы сканирующей зондовой микроскопии: Учебное пособие для студентов старших курсов высших учебных заведений. Нижний Новгород. РАН, Институт физики микроструктур, – 114 с. Миронов В.Л. Основы сканирующей зондовой микроскопии: Учебное пособие для студентов старших курсов высших учебных заведений. Нижний Новгород. РАН, Институт физики микроструктур, – 114 с. Нолтинг Б. Новейшие методы исследования биосистем. М.: Техносфера, – 256 с. Нолтинг Б. Новейшие методы исследования биосистем. М.: Техносфера, – 256 с. Полонская Н.Ю. Основы цитологической диагностики и микроскопическая техника. М.: «Академия», – 160 с. Полонская Н.Ю. Основы цитологической диагностики и микроскопическая техника. М.: «Академия», – 160 с. Синдо Д., Оикава Т. Аналитическая просвечивающая электронная микроскопия. М.: Техносфера, – 256 с. Синдо Д., Оикава Т. Аналитическая просвечивающая электронная микроскопия. М.: Техносфера, – 256 с. Bozzola, J. J. Electron microscopy: principles and techniques for biologists / J.J. Bozzola, Lonnie D. R. Jones and bartlett publishers. – – 652 p. Bozzola, J. J. Electron microscopy: principles and techniques for biologists / J.J. Bozzola, Lonnie D. R. Jones and bartlett publishers. – – 652 p.

18 Рекомендуемая (дополнительная) литература Бакаев А.А., Батаев В.А., Тушинский Л.И., Которов С.А., Буторин Д.Е., Суханов Д.А., Батаева З.Б., Смирнов А.И., Плохов А.В. Физические методы контроля материалов: Учебное пособие/Под. ред. А.А. Батаева. – Новосибирск: Изд-во НГТУ, – 103с. Бакаев А.А., Батаев В.А., Тушинский Л.И., Которов С.А., Буторин Д.Е., Суханов Д.А., Батаева З.Б., Смирнов А.И., Плохов А.В. Физические методы контроля материалов: Учебное пособие/Под. ред. А.А. Батаева. – Новосибирск: Изд-во НГТУ, – 103с. Гущина Ю.Ю., Звонкова М.Б. Применение сканирующего зондового микроскопа для исследования биологических объектов. Нижний Новгород. Научно-образовательный центр «Физика твердотельных наноструктур», – 32 с. Гущина Ю.Ю., Звонкова М.Б. Применение сканирующего зондового микроскопа для исследования биологических объектов. Нижний Новгород. Научно-образовательный центр «Физика твердотельных наноструктур», – 32 с. Карпу В.Я. Электронная микроскопия. – К.: «Вища школа», – 208 с. Карпу В.Я. Электронная микроскопия. – К.: «Вища школа», – 208 с. Козинец Г.И., Погорелов В.М., Шмаров Д.А., Боев С.Ф., Сазонов В.В. Клетки крови –современные технологии их анализа. М.: «Триада-фарм», – 200 с. Козинец Г.И., Погорелов В.М., Шмаров Д.А., Боев С.Ф., Сазонов В.В. Клетки крови –современные технологии их анализа. М.: «Триада-фарм», – 200 с. Ровенский Ю.А. Растровая электронная микроскопия нормальных и опухолевых клеток. М.: «Медицина», – 152 с. Ровенский Ю.А. Растровая электронная микроскопия нормальных и опухолевых клеток. М.: «Медицина», – 152 с. Reed S.J.B. Electron microprobe analysis and scanning electron microscopy in geology. University of Cambridge. – – 189 p. Reed S.J.B. Electron microprobe analysis and scanning electron microscopy in geology. University of Cambridge. – – 189 p.

19 mainz.de/FB/Medizin/Anatomie/workshop/EM/EMAtlas.html mainz.de/FB/Medizin/Anatomie/workshop/EM/EMAtlas.html mainz.de/FB/Medizin/Anatomie/workshop/EM/EMAtlas.html mainz.de/FB/Medizin/Anatomie/workshop/EM/EMAtlas.html

20 Вопросы к зачету Методы исследования в оптической микроскопии. Методы исследования в оптической микроскопии. Устройство и принцип работы конфокального лазерного сканирующего микроскопа. Устройство и принцип работы конфокального лазерного сканирующего микроскопа. Модификации и модели конфокальных лазерных сканирующих микроскопов. Модификации и модели конфокальных лазерных сканирующих микроскопов. Иммуноцитохимия и трассирование. Иммуноцитохимия и трассирование. Формирование изображения (Imaging) и «Живые краски» (флуоресцентные белки). Формирование изображения (Imaging) и «Живые краски» (флуоресцентные белки). Передача энергии посредством флуоресцентного резонанса (FRET). Передача энергии посредством флуоресцентного резонанса (FRET). Восстановление флуоресценции после фотовыжигания (FRAP). Восстановление флуоресценции после фотовыжигания (FRAP). Визуализация времени жизни во флуоресцирующем состоянии (FLIM). Визуализация времени жизни во флуоресцирующем состоянии (FLIM). Флуоресцентная корреляционная спектроскопия (FCS). Флуоресцентная корреляционная спектроскопия (FCS). Флуоресцентная in situ гибридизации (FISH). Флуоресцентная in situ гибридизации (FISH). Устройство и принцип работы просвечивающего электронного микроскопа. Устройство и принцип работы просвечивающего электронного микроскопа.

21 Устройство и принцип работы растрового электронного микроскопа. Устройство и принцип работы растрового электронного микроскопа. Модификации, модели просвечивающих и растровых электронных микроскопов. Модификации, модели просвечивающих и растровых электронных микроскопов. Основные этапы подготовки биологических объектов к просвечивающей электронной микроскопии. Основные этапы подготовки биологических объектов к просвечивающей электронной микроскопии. Оборудование и установки для подготовки биологических объектов к просвечивающей электронной микроскопии. Оборудование и установки для подготовки биологических объектов к просвечивающей электронной микроскопии. Физико-технические основы спектрального рентгеновского микроанализа. Физико-технические основы спектрального рентгеновского микроанализа. Основные этапы подготовки биологических объектов к спектральному рентгеновскому микроанализу. Основные этапы подготовки биологических объектов к спектральному рентгеновскому микроанализу. Устройство и принцип работы атомно-силового микроскопа. Устройство и принцип работы атомно-силового микроскопа. Методы АСМ. Методы АСМ. Основные этапы подготовки биологических объектов к атомно-силовой микроскопии. Основные этапы подготовки биологических объектов к атомно-силовой микроскопии. Факторы и артефакты в сканирующей зондовой микроскопии, качество – изображения. Факторы и артефакты в сканирующей зондовой микроскопии, качество – изображения.

22 Тематика рефератов Конфокальный лазерный сканирующий микроскоп в изучении морфофункциональных и биохимических особенностей клеток. Конфокальный лазерный сканирующий микроскоп в изучении морфофункциональных и биохимических особенностей клеток. Исследование молекулярной организации субклеточных структур при помощи конфокальной лазерной сканирующей микроскопии Исследование молекулярной организации субклеточных структур при помощи конфокальной лазерной сканирующей микроскопии Использование сканирующего электронного микроскопа в изучении нормальных и измененных органов, тканей и клеток. Использование сканирующего электронного микроскопа в изучении нормальных и измененных органов, тканей и клеток. Просвечивающая электронная микроскопия как метод оценки морфологических особенностей ультраструктур клетки. Просвечивающая электронная микроскопия как метод оценки морфологических особенностей ультраструктур клетки. Анализ локализации и распределения элементов в клетке при помощи спектрального рентгеновского микроанализа. Анализ локализации и распределения элементов в клетке при помощи спектрального рентгеновского микроанализа. Атомно-силовая микроскопия в исследовании морфологических и функциональных особенностей поверхности клеток. Атомно-силовая микроскопия в исследовании морфологических и функциональных особенностей поверхности клеток.