ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ АНАЛИЗ. ИФА - метод выявления антигенов с помощью соответствующих им антител, конъюгированных с ферментом-меткой. - презентация

1 ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ АНАЛИЗ

2 ИФА - метод выявления антигенов с помощью соответствующих им антител, конъюгированных с ферментом-меткой

3 Ферменты пероксидаза хрена пероксидаза хрена (о-фенилендиамин, тетраметилбензидин) (о-фенилендиамин, тетраметилбензидин) щелочная фосфатаза щелочная фосфатаза (фосфорные эфиры) (фосфорные эфиры) бета-галактозидаза бета-галактозидаза

4 Оборудование Дозаторы: Дозаторы: одноканальные пипетки - 5–40, 40–200 и 200– 1000 мкл; 8-канальные - 5–50 и 50–200 мкл; Вошер Вошер Холодильник с морозильной камерой Холодильник с морозильной камерой Термостат Термостат Шейкер Шейкер Спектрофотометр планшетный (ридер) Спектрофотометр планшетный (ридер) Дистиллятор Дистиллятор Набор мерной химической посуды Набор мерной химической посуды

5 Варианты ИФА ИФА ГомогенныйГетерогенный

6 Варианты ИФА ИФА КонкурентныйСэндвич

7 Этапы ИФА

8 ОСНОВНЫЕ ФАКТОРЫ ОБЕСПЕЧЕНИЯ КАЧЕСТВА ИФА Исправное оборудование. Исправное оборудование. Достаточная (высокая) квалификация персонала. Достаточная (высокая) квалификация персонала. Соблюдение правил при подготовке исследуемых образцов. Соблюдение правил при подготовке исследуемых образцов. Правильный выбор тест-систем, соблюдение условий их доставки и хранения. Правильный выбор тест-систем, соблюдение условий их доставки и хранения. Соблюдение правил при подготовке и постановке ИФА. Соблюдение правил при подготовке и постановке ИФА. Правильный учет и интерпретация результатов. Правильный учет и интерпретация результатов. Внешний и внутрилабораторный контроль качества. Внешний и внутрилабораторный контроль качества.

9 Средства измерения, подлежащие метрологической поверке Спектрофотометр (набором эталонных фильтров с различной оптической плотностью). Спектрофотометр (набором эталонных фильтров с различной оптической плотностью). Пипетки (гравиметрическим способом, взвешивая дистиллированную воду 10%, 50%, 100% от полного объема шкалы пипетки). Пипетки (гравиметрическим способом, взвешивая дистиллированную воду 10%, 50%, 100% от полного объема шкалы пипетки). Термометры (относительно эталонного термометра). Термометры (относительно эталонного термометра).

10 КОНТРОЛЬ РАБОТЫ ПЛАНШЕТНОГО СПЕКТРОФОТОМЕТРА Смешать 1:1 дистиллированную воду и 1М серную кислоту; Смешать 1:1 дистиллированную воду и 1М серную кислоту; разлить по 200 мкл во все лунки планшета (планшет предварительно должен быть промыт р-ром ФСБ-Т); разлить по 200 мкл во все лунки планшета (планшет предварительно должен быть промыт р-ром ФСБ-Т); измерить оптическую плотность на 450 нм относительно воздуха; измерить оптическую плотность на 450 нм относительно воздуха; ОП не должна превышать 0,05. ОП не должна превышать 0,05.

11 КОНТРОЛЬ РАБОТЫ АВТОМАТИЧЕСКИХ ПИПЕТОК Необходимы метрологическим путем поверенные весы и разновесы. Необходимы метрологическим путем поверенные весы и разновесы. Выставить пипетку на объём 50 % от полного объёма шкалы пипетки (или наиболее часто используемый объём). Выставить пипетку на объём 50 % от полного объёма шкалы пипетки (или наиболее часто используемый объём). Отобрать соответствующее количество дистиллированной воды. Отобрать соответствующее количество дистиллированной воды. Вылить воду в сухую, предварительно взвешенную, пробирку и сделать повторное взвешивание. Вылить воду в сухую, предварительно взвешенную, пробирку и сделать повторное взвешивание. 1 мкл – 1 мг 1 мкл – 1 мг

12 ТЕРМОСТАТ Необходимо в термостате на полке иметь термометр (поверенный). Необходимо в термостате на полке иметь термометр (поверенный). В термостатах без вентилирования температура в разных зонах камеры может существенно различаться. В термостатах без вентилирования температура в разных зонах камеры может существенно различаться. В современных термостатах, как правило, есть вентилятор создающий равномерность температуры по всему объему. В современных термостатах, как правило, есть вентилятор создающий равномерность температуры по всему объему.

13 АВТОМАТИЧЕСКИЕ ВОШЕРЫ И РУЧНЫЕ ГРЕБЁНКИ Необходимо следить за состоянием каналов; их засорение приводит к снижению эффективности отмывки. Необходимо следить за состоянием каналов; их засорение приводит к снижению эффективности отмывки. Требуется ежедневная промывка системы дистиллированной водой (не оставляйте вошер заполненным промывочным раствором на ночь). Требуется ежедневная промывка системы дистиллированной водой (не оставляйте вошер заполненным промывочным раствором на ночь). Наличие микробиологических заростов в шлангах, каналах, ёмкостях уменьшает специфичность анализа. Наличие микробиологических заростов в шлангах, каналах, ёмкостях уменьшает специфичность анализа. Обязательно, как минимум, раз в неделю промывать всю систему вошера 70% спиртом или другим раствором, рекомендованным инструкцией к прибору. Обязательно, как минимум, раз в неделю промывать всю систему вошера 70% спиртом или другим раствором, рекомендованным инструкцией к прибору.

14 ДИСТИЛЛЯТОР Правильная настройка дистиллятора, обеспечивающая требуемое качество дистиллированной воды: удельная проводимость при 20 °С не более 0,0005 см/м, рН 5,0-7,0. Правильная настройка дистиллятора, обеспечивающая требуемое качество дистиллированной воды: удельная проводимость при 20 °С не более 0,0005 см/м, рН 5,0-7,0. Периодическая профилактическая чистка дистиллятора. Периодическая профилактическая чистка дистиллятора. Стерилизация шлангов и бутылей (автоклавирование, прожаривание в сухожаре) с целью исключения контаминации воды. Стерилизация шлангов и бутылей (автоклавирование, прожаривание в сухожаре) с целью исключения контаминации воды.

15 ПОДГОТОВКА ОБРАЗЦОВ Сыворотка крови Сыворотка крови Завершённое формирование фибринового сгустка Завершённое формирование фибринового сгустка (фибрин – источник ложноположительных результатов) (фибрин – источник ложноположительных результатов) Исключить возможность контаминации одного образца другим (использование индивидуальных стеклянных палочек или наконечников для обведения сгустка). Исключить возможность контаминации одного образца другим (использование индивидуальных стеклянных палочек или наконечников для обведения сгустка). Возможен частичный гемолиз, но не допускается клеточная взвесь (видно по преципитации эритроцитов в лунках планшета). Возможен частичный гемолиз, но не допускается клеточная взвесь (видно по преципитации эритроцитов в лунках планшета). Сыворотки должны быть без проростов, при длительном хранении (более 3 дней) лучше заморозить. Сыворотки должны быть без проростов, при длительном хранении (более 3 дней) лучше заморозить. Плазма Плазма Должна быть свободна от тромбоцитов. Должна быть свободна от тромбоцитов.

16 ПРАВИЛА ДЕЗИНФЕКЦИИ В ЛАБОРАТОРИИ Исследуемые и контрольные образцы - потенциально инфекционный материал! Работать в резиновых перчатках и медицинских масках. Оставшиеся исследуемые образцы, посуду и наконечники, с ними контактировавшие, замачивать в 6% перекиси водорода. Посуда и наконечники, не контактировавшие с образцами, не требуют дезинфекции. Поверхность стола, пипетки, перчатки в процессе работы дезинфицировать только 70% спиртом. Категорически запрещается использовать для этого растворы перекиси водорода, хлорамина или гипохлорита натрия.

17 Работа с наконечниками для автоматических пипеток Желательно одноразовое использование наконечников, особенно используемых для работы с конъюгатом и субстратным раствором. Желательно одноразовое использование наконечников, особенно используемых для работы с конъюгатом и субстратным раствором. В случае невозможности одноразового использования наконечники для сывороток, конъюгата и субстратного раствора должны быть разделены. Замачивание для инактивации в перекиси водорода только наконечников, используемых для дозирования сывороток. В случае невозможности одноразового использования наконечники для сывороток, конъюгата и субстратного раствора должны быть разделены. Замачивание для инактивации в перекиси водорода только наконечников, используемых для дозирования сывороток. Для конъюгата и субстратного раствора в одной тест- системе можно несколько раз использовать наконечники. В этом случае после использования ополоснуть их в дист. воде, 70% спирте и сложить в подписанную (название тест-системы, «конъюгат» или «ТМБ») чашку Петри. Для конъюгата и субстратного раствора в одной тест- системе можно несколько раз использовать наконечники. В этом случае после использования ополоснуть их в дист. воде, 70% спирте и сложить в подписанную (название тест-системы, «конъюгат» или «ТМБ») чашку Петри.

18 Методика мытья наконечников замачивание в 6% перекиси водорода, можно с 0,5% жидкого моющего средства на 24 часа замачивание в 6% перекиси водорода, можно с 0,5% жидкого моющего средства на 24 часа категорически запрещается использование моющих средств с биологически активными веществами и СМС в виде любых стиральных порошков! категорически запрещается использование моющих средств с биологически активными веществами и СМС в виде любых стиральных порошков! промывка 10 раз холодной водой промывка 10 раз холодной водой промывка 2 раза дистиллированной водой промывка 2 раза дистиллированной водой кипячение в третьей порции дистиллированной воды не менее 30 минут кипячение в третьей порции дистиллированной воды не менее 30 минут сухожар 80° С не менее 5 – 6 часов до полного высыхания или поместить в 70% спирт не менее чем на 2 часа, а затем высушить при комнатной температуре на воздухе сухожар 80° С не менее 5 – 6 часов до полного высыхания или поместить в 70% спирт не менее чем на 2 часа, а затем высушить при комнатной температуре на воздухе раскладка наконечников в штативы пинцетом! раскладка наконечников в штативы пинцетом!

19 ПОДГОТОВКА К РАБОТЕ Внимательно изучить инструкцию по применению тест-системы. Внимательно изучить инструкцию по применению тест-системы. Не использовать тест-системы с истекшим сроком годности. Не использовать тест-системы с истекшим сроком годности. Не смешивать реактивы из разных серий наборов. Не смешивать реактивы из разных серий наборов. Компоненты набора перед началом ИФА должны быть прогреты до комнатной температуры. Компоненты набора перед началом ИФА должны быть прогреты до комнатной температуры. Разборный планшет перед вскрытием необходимо выдержать при комнатной температуре не менее 30 мин для предотвращения конденсации влаги. Разборный планшет перед вскрытием необходимо выдержать при комнатной температуре не менее 30 мин для предотвращения конденсации влаги. Кристаллы в концентрате отмывающего буфера должны быть растворены. Кристаллы в концентрате отмывающего буфера должны быть растворены.

20 Сухие компоненты набора должны быть восстановлены заранее и выдержаны не менее 15 мин до использования. Сухие компоненты набора должны быть восстановлены заранее и выдержаны не менее 15 мин до использования. Неиспользованные стрипы должны быть немедленно упакованы и тщательно запечатаны в пакет для планшета с влагопоглотителем. Неиспользованные стрипы должны быть немедленно упакованы и тщательно запечатаны в пакет для планшета с влагопоглотителем. Необходимо следить за состоянием влажной камеры – исключить бактериальные заросты (желательно камеру готовить ежедневно); влажная камера должна быть предварительно прогрета до температуры инкубации. Необходимо следить за состоянием влажной камеры – исключить бактериальные заросты (желательно камеру готовить ежедневно); влажная камера должна быть предварительно прогрета до температуры инкубации. ПОДГОТОВКА К РАБОТЕ

21 ПОСТАНОВКА РЕАКЦИИ Строгое выполнение условий проведения ИФА, Строгое выполнение условий проведения ИФА, указанных в инструкции!

22 ВНЕСЕНИЕ ОБРАЗЦОВ Контролировать качество вносимых исследуемых образцов (отсутствие сгустков, клеточных элементов крови, прозрачность). Контролировать качество вносимых исследуемых образцов (отсутствие сгустков, клеточных элементов крови, прозрачность). При внесении образца в разводящий раствор – тщательное перемешивание пипетированием. При внесении образца в разводящий раствор – тщательное перемешивание пипетированием. Исключить манипуляции с образцами над рабочим планшетом. Исключить манипуляции с образцами над рабочим планшетом. Продолжительность внесения образцов в лунки должна составлять не более 20-30% от времени инкубации. Продолжительность внесения образцов в лунки должна составлять не более 20-30% от времени инкубации.

23 ВНЕСЕНИЕ КОНЪЮГАТА Использовать одноразовую посуду и наконечники. Использовать одноразовую посуду и наконечники. При повторном использовании – отдельно выделенные наконечники и посуда, которые не обрабатывать дезинфицирующими и моющими средствами. При повторном использовании – отдельно выделенные наконечники и посуда, которые не обрабатывать дезинфицирующими и моющими средствами. При одновременной инкубации сыворотки и конъюгата – раствор конъюгата вносить, не касаясь наконечниками сывороточного раствора. При одновременной инкубации сыворотки и конъюгата – раствор конъюгата вносить, не касаясь наконечниками сывороточного раствора.

24 ИНКУБАЦИЯ Контроль температуры в термостате (по дополнительному термометру). Контроль температуры в термостате (по дополнительному термометру). Предварительный прогрев влажной камеры (если она используется). Предварительный прогрев влажной камеры (если она используется). Тщательное заклеивание планшета клейкой плёнкой, предотвращающее испарение жидкости. Тщательное заклеивание планшета клейкой плёнкой, предотвращающее испарение жидкости. Размещение планшетов в один слой. Размещение планшетов в один слой. Строгое соблюдение продолжительности инкубации. Строгое соблюдение продолжительности инкубации.

25 ПРОМЫВКА ПЛАНШЕТА Соответствие состояния промывающих устройств требованиям: равномерность внесения-удаления промывочного раствора, чистота ёмкостей и шлангов. Соответствие состояния промывающих устройств требованиям: равномерность внесения-удаления промывочного раствора, чистота ёмкостей и шлангов. Полное заполнение лунок промывочным раствором и полное его удаление в каждом цикле промывки. Полное заполнение лунок промывочным раствором и полное его удаление в каждом цикле промывки. Время экспозиции промывочного раствора в лунке при каждом цикле промывки должно быть не менее 10 сек (если не оговорено по-другому в инструкции). Время экспозиции промывочного раствора в лунке при каждом цикле промывки должно быть не менее 10 сек (если не оговорено по-другому в инструкции). Тщательное удаление влаги из лунок после промывки. Тщательное удаление влаги из лунок после промывки. Не допускать подсыхания лунок между операциями. Не допускать подсыхания лунок между операциями. Смена фильтровальной бумаги на разных стадиях постановки ИФА. Смена фильтровальной бумаги на разных стадиях постановки ИФА.

26 ПРИГОТОВЛЕНИЕ И ВНЕСЕНИЕ РАСТВОРА ХРОМОГЕНА Использовать одноразовую посуду и наконечники. Использовать одноразовую посуду и наконечники. При повторном использовании – отдельные наконечники и посуда, которые При повторном использовании – отдельные наконечники и посуда, которые не обрабатывать дезинфицирующими и моющими средствами. не обрабатывать дезинфицирующими и моющими средствами. Категорически недопустимо перекрёстное использование посуды и наконечников для работы с разными хромогенами. Категорически недопустимо перекрёстное использование посуды и наконечников для работы с разными хромогенами. Исключить воздействие прямого солнечного света. Исключить воздействие прямого солнечного света.

27 ИНКУБАЦИЯ С РАСТВОРОМ ХРОМОГЕНА Исключить воздействие света. Исключить воздействие света. Соответствие температуры инкубации требованиям (18-25°С). Соответствие температуры инкубации требованиям (18-25°С). Строгое соблюдение продолжительности инкубации. Строгое соблюдение продолжительности инкубации. Визуальный контроль характера окрашивания раствора в лунках (неравномерное окрашивание, появление окрашенных капель на стенках лунок – результат некачественной работы). Визуальный контроль характера окрашивания раствора в лунках (неравномерное окрашивание, появление окрашенных капель на стенках лунок – результат некачественной работы).

28 ОСТАНОВКА РЕАКЦИИ При внесении стоп-реагента необходимо добиваться полного перемешивания растворов (не пипетированием)

29 УЧЁТ РЕЗУЛЬТАТОВ Исправный, поверенный спектрофотометр. Исправный, поверенный спектрофотометр. Предварительный прогрев прибора. Предварительный прогрев прибора. Сопоставить визуальную оценку планшета с распечаткой. Причиной повышенной ОП могут быть: загрязнение дна лунки, дефект пластика, посторонние включения в растворе, загрязнение линзы спектрофотометра. Сопоставить визуальную оценку планшета с распечаткой. Причиной повышенной ОП могут быть: загрязнение дна лунки, дефект пластика, посторонние включения в растворе, загрязнение линзы спектрофотометра. Исключить влияние артефактов позволяет измерение ОП относительно фильтра 620 нм Исключить влияние артефактов позволяет измерение ОП относительно фильтра 620 нм

30 ОЦЕНКА РЕЗУЛЬТАТОВ Оценить соответствие полученных контрольных значений ОП требованиям, заложенным в инструкции по применению (валидность теста). Оценить соответствие полученных контрольных значений ОП требованиям, заложенным в инструкции по применению (валидность теста). Сопоставить полученные контрольные значения ОП с паспортными (при правильно проведённом анализе не должно быть существенных отличий). Сопоставить полученные контрольные значения ОП с паспортными (при правильно проведённом анализе не должно быть существенных отличий).

31 ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ ТЕСТ- СИСТЕМЫ При определении антигена - минимальная концентрация вещества, определяемая данной тест- системой. При определении антигена - минимальная концентрация вещества, определяемая данной тест- системой. При определении антител – процент образцов, давших положительный результат в данной тест-системе, от общего количества обследованных образцов, содержащих выявляемые антитела. При определении антител – процент образцов, давших положительный результат в данной тест-системе, от общего количества обследованных образцов, содержащих выявляемые антитела. СПЕЦИФИЧНОСТЬ ТЕСТ-СИСТЕМЫ Процент образцов, давших отрицательный результат в данной тест-системе, от общего количества обследованных образцов, действительно не содержащих выявляемый маркёр.

32 Возможные причины занижения чувствительности анализа Уменьшение времени инкубации (как правило, субстратной реакции). Уменьшение времени инкубации (как правило, субстратной реакции). Использование загрязнённой посуды и наконечников. Использование загрязнённой посуды и наконечников. Замачивание посуды и наконечников в перекиси водорода или хлорсодержащих растворах без последующего кипячения в процессе мытья. Замачивание посуды и наконечников в перекиси водорода или хлорсодержащих растворах без последующего кипячения в процессе мытья. Обработка рабочих поверхностей, пипеток, перчаток в процессе работы перекисью водорода или хлорсодержащими растворами. Обработка рабочих поверхностей, пипеток, перчаток в процессе работы перекисью водорода или хлорсодержащими растворами. Плохая отмывка после инкубации сывороток в тестах, выявляющих антитела. Плохая отмывка после инкубации сывороток в тестах, выявляющих антитела. Растворы, не нагретые перед постановкой до комнатной температуры. Растворы, не нагретые перед постановкой до комнатной температуры. Размещение планшетов в термостате стопкой. Размещение планшетов в термостате стопкой. Низкая температура в лабораторных комнатах. Низкая температура в лабораторных комнатах. Нарушение правил и сроков хранения вскрытых компонентов при дробном использовании набора. Нарушение правил и сроков хранения вскрытых компонентов при дробном использовании набора.

33 Возможные причины снижения специфичности анализа Контаминированный вошер или низкого качества дистиллированная вода. Контаминированный вошер или низкого качества дистиллированная вода. Плохая отмывка на стадии конъюгата. Плохая отмывка на стадии конъюгата. Длительное внесение образцов по отношению к времени инкубации. Длительное внесение образцов по отношению к времени инкубации. Неправильная работа с пипетками (контаминация пипетки, неправильное дозирование). Неправильная работа с пипетками (контаминация пипетки, неправильное дозирование). Неправильное использование влажной камеры, липкой пленки, приводящее к подсыханию раствора. Неправильное использование влажной камеры, липкой пленки, приводящее к подсыханию раствора. Многократное использование наконечников и посуды для субстратного раствора (ТМБ). Многократное использование наконечников и посуды для субстратного раствора (ТМБ). Нерастворенные кристаллы в концентрате отмывающего раствора. Нерастворенные кристаллы в концентрате отмывающего раствора. Заросшие или с наличием клеточных элементов сыворотки. Заросшие или с наличием клеточных элементов сыворотки. Неисправный планшетный спектрофотометр. Неисправный планшетный спектрофотометр.