Методы исследования макромолекул © Karabelsky A.V. 19.02.2011. - презентация

1 Методы исследования макромолекул © Karabelsky A.V

2 ОБЩАЯ биохимическая стратегия исследования макромолекул Получение ОБЪЕКТА исследования (бактерии, дрожжи, клетки тканей) Обработка объекта исследования (лизис, разрушение, измельчение) Выделение нужной фракции или нужной макроструктуры (мембраны, органеллы, ядро, рибосомы, микросомы, цитоплазмы и др.) Обработка препарата. Выделение фракции белков (липидов, ДНК, РНК и т.д.) Детекция нужной молекулы Выделение и очистка нужной молекулы ЭКСТРАКЦИЯЭКСТРАКЦИЯ © Karabelsky A.V

3 1. Получение объекта исследования -Культивирование бактерий и дрожжей внеобходимых условиях. Сбор клеток осуществляется центрифугированием или фильтрацией. -Получение ткани животного, человека (или использование культур клеток). © Karabelsky A.V

4 Центрифугирование Клетки хорошо седиментируются при незначительных значениях g. В лабораторных условиях достаточно 5000 об/мин минут – чтобы все клетки оказались на дне пробирки. © Karabelsky A.V

5 2. Обработка объекта. © Karabelsky A.V

6 Основные типы обработкки. Гомогенизатор Поттера Ферментативный лизис Механическое разрушение замороженных тканей (размолом или с помощью вращающихся ножей; под большим давлением; осмотическим шоком; многократным чередованием замораживания и оттаивания ) © Karabelsky A.V

7 Лизис клеток бактерий (распространенный способ) 1.Добавляют к клеткам лизоцим, ЭДТА в растворе сахарозы растворение наружных мембран. Мембраны превращаются в сферопласты (только внутренняя мембрана) 2.Гомогенизация сферопластов. 3.Вместо гомогенизации можно добавить детергент (если не важна нативность белков). 4.Для выделения плазмидной ДНК можно миновать стадию сферопластов и просто обработать клетки щелочью в присутствии детергента. 5.Крайний вариант – ультразвук. Но в этом случае возможно дробление белка или ДНК(РНК). © Karabelsky A.V

8 В основе методов экстрагирования лежит размельчение материала в соответствующем буфере с последующим центрифугированием смеси. © Karabelsky A.V

9 2-3. Обработка объекта и выделение нужной фракции ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЕДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЕ © Karabelsky A.V

10 Константы седиментации различных частиц © Karabelsky A.V

11 3. Варианты центрифугирования (для молекул, которые незначительно отличаются по размеру и величине S) © Karabelsky A.V

12 Методы детекции нужных фракций © Karabelsky A.V

13 3. Варианты экстракции (в зависимости от целей) 1. Если есть опасность действия протеаз – все процедуры проводят на холоду + добавляют стабилизаторы (сахароза, глицерин, ЭДТА) 2. Для выделения суммарной фракции белков мембран можно обработать их детергентами (SDS, тритон x-100). 3. Если цель-это очистка нуклеиновых кислот, то можно добавить к раствору протеазы. Таким образом, избавиться от белков. 4. Для отделения РНК от ДНК – можно добавить фермент, расщепляющий ту или иную кислоту. © Karabelsky A.V

14 4. Выделение суммарных фракций белков. Один из вариантов выделения суммарных фракций белков – добавление к раствору сульфата аммония до 80% насыщения (высаливание). Возможно добавление детергентов или мочевины, если не важна нативность белка. О процессе высаливания см. дальше. © Karabelsky A.V

15 4. Выделение суммарной фракции нуклеиновых кислот. Основной способ – это обработка смесью фенол-хлороформ. Белки разрушаются и легко отделяются центрифугированием. © Karabelsky A.V

16 Целью большинства биохимических исследований является изучение свойств различных белков. Поэтому в дальнейшем будут приведены описания основных методик работы с белковыми препаратами. Будут описаны методы детекции белка в растворе и методы его выделения и очистки. © Karabelsky A.V

17 5. Основные методы детекции белков !! 1.Электрофорез 2. Иммуноблоттинг 3. Определение концентрации белка в растворе (колориметрические и спектрофотометрические методы) © Karabelsky A.V

18 Электрофорез. В основе метода электрофореза лежит миграция макромолекул в электрическом поле. Движение белков обусловлено наличием на их поверхности заряженных радикалов АК ДНК и РНК – заряжены отрицательно всегда © Karabelsky A.V

19 Электрофорез молекул. Раствор с препаратом помещают в гель (подобный пищевому желе), причем этот гель подобен сетке – со строго определенным размером пор. Гель находится в буфере, через который может проходить ток. При подаче тока молекулы будут двигаться в определенном направлении (в зависимости от своего суммарного заряда) через поры этого геля. Причем более крупные частицы будут двигаться медленнее – так как постоянно будут натыкаться на сетку геля. Через определенное время мы получим разделение молекул по размеру и по заряду. © Karabelsky A.V

20 Варианты гелей. Агарозный гель. В основном используется для разделения нуклеиновых кислот. Агароза – чистая фракция природного полисахарида агара. Поставляется в порошках. Гелеобразование происходит после растворения агарозы в буфере, нагревания до кипения и остывании. При остывании нити агарозы за счет водородных связей образуют жгуты. Жгуты перекрещиваются и образуют пористую структуру. Размер пор зависит от исходной концентрации агарозы. (0.8% гель для ДНК-ЭФ) © Karabelsky A.V

21 Полиакриламидный гель (ПААГ, PAAG) Полиакриламид – продукт полимеризации акриламида. Полиакриламидные нити могут быть связаны между собой с помощью молекул N,N- метиленбисакриламида. После совместной полимеризации получаем структуры с порами. Размер пор зависит от исходных концентраций обоих компонентов. © Karabelsky A.V

22 Структура ПААГ © Karabelsky A.V

23 Приготовление геля. Смешивают растворы АА и БисАА в нужном буфере. Добавляют воду, инициатор полимеризации (персульфат аммония) и ускоритель полимеризации (ТEMED) © Karabelsky A.V

24 Разделение белков М (кДа) %АА (процент ПААГ) >300 5 © Karabelsky A.V

25 Варианты электрофореза Вертикальный (в основном в ПААГ, для разделения белков) Горизонтальный (агарозный гель, разделение нуклеиновых кислот) © Karabelsky A.V

26 Камера для ЭФ © Karabelsky A.V

27 ЭФ в ПААГ в присутствии ДСН ДСН (додецилсульфат натрия, SDS)– детергент. Связывается с белками за счет гидрофобных взамодействий и растягивает их. Сульфокислота ДСН делает все белки ОТРИЦАТЕЛЬНО заряженными. Таким образом возможно разделение белков только по их размеру. При этом скорость миграции белка при определенной напряженности электрического поля - величина, зависящая только от размера белка. Ее называют электрофоретической подвижностью. © Karabelsky A.V

28 Использование ЭФ-маркеров В строгих условиях опыта величина электрофоретической подвижности - это постоянная величина. Поэтому при проведении ЭФ можно сравнить ее с подвижностью известных белков (маркёров) с известной молекулярной массой. Таким образом можно определить размер исследуемого белка. © Karabelsky A.V

29 Проведение ЭФ в ПААГ с ДСН © Karabelsky A.V

30 Варианты белкового ЭФ. Нативный ЭФ (кислый или щелочной) Двумерный ЭФ Электрофорез в ИЭТ Изоэлектрофокусирование Изотахофорез Диск-ЭФ © Karabelsky A.V

31 Двумерный ЭФ 1й этап – разделение по размеру в одних условиях. Поворот геля на 90 градусов и проведение ЭФ в других условиях (например в градиенте рН или в буфере с другим рН) © Karabelsky A.V

32 ЭФ в ИЭТ рН буфера для ЭФ соответствует ИЭТ (изоэлектрическая точка) исследуемого белка. При подаче напряжения белки с отличной ИЭТ мигрируют к разным полюсам. Нужный белок остается в лунке геля. © Karabelsky A.V

33 Изоэлектрофокусирование В этом методе используется градиент рН в постоянной электрическом поле. При этом белки двигаются до тех пор, пока не станут электронейтральными. Есть методы ПРЕПАРАТИВНОГО ИЭФ. © Karabelsky A.V

34 Изотахофорез В этом методе белки разделяются в Градиенте напряжения. Каждая белковая зона будет обладать собственной подвижностью – в этой зоне будет свое значение напряжения. Граница между зонами четкая. Размер зоны зависит от исходного количетва белка. © Karabelsky A.V

35 Диск-ЭФ В одной системе используют два геля разной пористости. Верхний гель служит для концентрирования белковой пробы. Нижний гель – для разделения белков по размеру. © Karabelsky A.V

36 Диск-ЭФ Концентрирующий Гель (6%) Разделяющий гель % или др. © Karabelsky A.V

37 Разберем последовательно процесс проведения Диск-ЭФ Приготовление пробы. Пробу белка после осаждения, выделения или очистки осаждают 10% ТХУ. Осадок белков растворяют в буфере для проб, который содержит буфер трис-HCl-ЭДТА, глицерин, меркаптоэтанол, бромфеноловый синий и ДСН. © Karabelsky A.V

38 Приготовление геля 1.Сперва в камеру для геля заливают разделяющий гель (например 12% ПААГ). Его готовят на буфере с щелочным значением рН (около 9). 2.После застывания геля сверху наливают раствор концентрирующего геля (обычно 6%), в буфере с рН 6.8. Делают лунки для проб. © Karabelsky A.V

39 Установка геля. Гель устанавливают в камеру и наливают сверху трис-глициновый буфер. © Karabelsky A.V

40 Нанесение пробы Пробы перед нанесение кипятят 5-10 минут и наносят в лунки геля. В соседние лунки помещают пробу с маркерными белками с известной подвижностью. © Karabelsky A.V

41 Проведение ЭФ Сперва ЭФ проходит при 50В (около 10мА). После того, как белки войдут в разделяющий гель – ЭФ проводят при В. Белки мигрируют от – к +. Скорость миграции контролируют по степени миграции красителя (он всегда идет первым). © Karabelsky A.V

42 Проявка геля. После ЭФ гель вытаскивают. Обрабатывают ИПС для фиксации белков в порах геля и помещают в раствор с красителем (обычно кумасси синий) на 1-2 часа. После этого гель отмывают в уксусной кислоте. Белки на геле видны в виде полос синего цвета. © Karabelsky A.V

43 2. Метод блоттинга Существует несколько видов блоттинга. Все они сводятся к тому, что иследуемый образец переносят на нитроцеллюлозный фильтр и помещают этот фильтр в раствор, в котором содержится вещество, способное гибридизоваться с образцом. Места гибридизации видны после специальных методов проявки. © Karabelsky A.V

44 Варианты блоттинга Саузерн-блоттинг : перенос ДНК на фильтр (в дальнейшем возможна гибридизация с меченой ДНК за счет комплементарности радиоавтография) Нозерн-блоттинг: перенос РНК Вестерн-блоттинг: перенос белков. Обычно проявку белков осуществляют за счет гибридизации белка с антителами. Поэтому этот вид блоттинга называют иммуноблоттингом. © Karabelsky A.V

45 Вестерн-блот. Перенос © Karabelsky A.V

46 Вестерн-блот. Проявка © Karabelsky A.V

47

48

49 3. Определение концентрации белка в растворе Колориметрические методы Биуретовый метод – образование в щелочной среде комплекса пептидных связей с ионами меди. 540нм Метод Лоури – Образование комплекса ароматических АК с реактивом Фолина + биуретовая реакция. 750 нм Метод Брэдфорд – основан на связывании с белками красителя кумасси синего, спектр поглощения которого при этом меняется. 595 нм. Спектрофотометрический метод. Основан на способности ароматических АК поглощать УФ свет 280нм. Этот метод используется и для определения концентрации нуклеиновых кислот. © Karabelsky A.V

50 Методы выделения и очистки белков. 1.Фракционирование и концентрирование. -Осаждение -Ультрафильтрация 2. Разделение и очистка -гель-фильтрация -Хроматография © Karabelsky A.V

51 Фракционирование и концентрирование белков. Методы осаждения. 1.Высаливание. Добавление к раствору сульфата аммония до определенной степени насыщения. 2.Осаждение органическими растворителями (ацетоном) 3.Осаждение органическими полимерами (ПЭГ) © Karabelsky A.V

52 Методы осаждения Высаливание Осаждение органическими растворителями или ПЭГ © Karabelsky A.V

53 Ультрафильтрация Препарат с белком прогоняют через мембрану, которая имеет поры определенного диаметра. Белки, размер которых меньше диаметра пор, спокойно через них проходят. Крупные белки при этом концентрируются. © Karabelsky A.V

54

55 Гель-фильтрация (гель- проникающая хроматография) © Karabelsky A.V

56 Многообразие гелей для гель- фильтрации © Karabelsky A.V

57 Метод ХРОМАТОГРАФИИ -Ионообменная -Аффинная -Иммунноафинная -На окрашенных адсорбентах -Распределительная Все эти методы чаще всего применяются на колонках – колоночная хроматография. © Karabelsky A.V

58 Ионообменная хроматография © Karabelsky A.V

59 Сорбенты для ионообменников Анионообменники - ионообменная группа DEAE – диэтиламиноэтил. Катионообменники – Карбоксиметильная группа. © Karabelsky A.V

60 Ход ионообменной хроматографии 1.Посадка белка на колонку (в буфере, рН которого отличается от изоточки белка на в ту или другую сторону) 2.Промывка колонки исходным буфером (при этом несорбированные белки удаляются) 3.Элюция (десорбция) белка, за счет смены буфера. Новый буфер на 1-2 единицы рН отличается от исходного (его рН находится по другую сторону изоточки белка). Белок сходит с колонки. Элюцию можно осуществлять и в градиенте концентрации соли. © Karabelsky A.V

61 Аффинная хроматография Метод основан на специфичном взаимодействии белка с некоторыми веществами (рецептор- лиганд, фермент-субстрат, белок-антитело и т.д.) Лиганд изначально сорбирован на колонке. При нанесении пробы он связывается с белком. Элюцию белка можно проводить разными способами. Самый простой способ – резкое изменение рН или высокие концентрации соли. © Karabelsky A.V

62 Иллюстрация аффинной хроматографии © Karabelsky A.V

63 Иммунноаффинная хроматографии Этот метод является вариантом обычной аффинной хроматографией. В качестве лиганда используются специфические антитела. © Karabelsky A.V

64 Хроматография на окрашенных адсорбентах Хроматография на окрашенных адсорбентах получила широкое распространение, что обусловлено относительной дешевизной и высокой емкостью сорбента. Специфичность адсорбентов, связанных с красителем, такова, что их можно считать аффинными адсорбентами, хотя используемый краситель имеет мало сходства и истинным лигандом. Поэтому этот тип хроматографии часто называют псевдо-аффинной хроматографией. Чаще всего окрашенные адсорбенты используют для очистки нуклеотид-связывающих белков. При низкой ионной силе и относительно низких значениях рН окрашенные адсорбенты являются эффективными катионообменниками, так как благодаря наличию множества отрицательных зарядов они связывают основные белки. В некоторых случаях, адсорбент обладает высоким сродством к белкам, которые не имеют нуклеотид-связывающих центров, например, к альбумину и интерферону. © Karabelsky A.V

65 Краситель на поверхности сорбента F3GA © Karabelsky A.V

66 Распределительная хроматография В основе этого метода лежит разделение веществ по их растворимости в различных растворителях. Часто этот метод называют гидрофобной хроматографией. Распространенный вариант - модификация агарозы алифатическими углевородородами. Они создают на поверхности сорбента сильно-гидрофобную среду, за счет чего белки могут залипать своими гидрофобными группами. Элюцию проводят либо просто водой, либо снижением концентрации солей (например сульфата аммония). © Karabelsky A.V