1 Аналитическое ультрацентрифугирование 1913. A. Думанский предложил использовать ультрацентрифугирование для определения размеров коллоидальных частиц. - презентация

1 1 Аналитическое ультрацентрифугирование A. Думанский предложил использовать ультрацентрифугирование для определения размеров коллоидальных частиц T. Сведберг и Д. Николс сконструировали первую ультрацентрифугу, содержащую оптическую систему для анализа частиц в поле ультрацентрифуги. Годом позже Сведберг наблюдал уменьшение поглощения у вершины центрифужной кюветы для раствора гемоглобина. В 1926 Сведберг провел первое измерение молекулярных весов гемоглобина и овальбумина методом седиментационного равновесия, а в 1927 году он определил молекулярный вес гемоглобина сочетанием методов седиментации и диффузии. Сведберг пришел к пророческому выводу, что белки представляют макромолекулы, состоящие из большого числа атомов, соединенных ковалентными связями. Золотые годы ультрацентрифуги ( ) Забвение ( ), Возрождение ( )

2 2 Роторы ультрацентрифуги Ротор в аналитической ультрацентрифуге способен вращаться при скоростях до об/мин. Он должен выдерживать большие гравитационные напряжения. Так при скорости об/мин гравитационное поле ультрацентрифуги достигает g. При этих условиях масса 1 г имеет кажущийся вес 300 кг.

3 3 Кюветы ультрацентрифуги 1. Одно-секториальная ячейка 2. Би-секториальная ячейка. 3. Би-секториальная ячейка с наслаи- ванием или границе-образующая ячейка Наслаиваемый растворитель

4 4 Оптические системы регистрации в ультрацентрифуге Оптика поглощения Интерферометрическая Шлирен- оптика оптика

5 5 Два типа экспериментов в ультрацентрифуге

6 6 Скоростная седиментация Седиментационное равновесие Угловая скоростьБольшаяМаленькая АнализКак функция времени (3 часа) Равновесие (после 24 часов) МакромолекулаДвижетсяВ равновесии Измерения Анализ седиментирующей границы Распределение молекул в кювете Вычисляемые параметры Форма макромолекулы и ее масса Масса макромолекулы Два типа экспериментов в ультрацентрифуге

7 7 Уравнение Ламма Уравнение Ламма описывает процессы транспорта в ультрацентрифуге. Оно получается введением дополнительного члена в первое уравнение Фика. J x = –D[dC/dx] + uC(x) поскольку u = sω 2 x J x = –D [dC/dx] + sω 2 xC(x) Диффузионый и седиментационный вклады (dC/dt)r = –1/r {d/dr [ω 2 r 2 s C – Dr (dc/dr)t]}t Идеальный процесс Процесс в ультрацентрифуге Уравнение Ламма не имеет аналитического решения!!!!

8 8 Определение коэффициента седиментации из профиля движущейся границы. Рутинная мода: s and D четко определены. Скорость движущейся границы определяется скоростью изменения ее радиальной координаты во времени dr b /dt. u = dr b /dt = ω 2 rs После интегрирования ln r b (t)/r b (t 0 ) = ω 2 s(t-t 0 ) Наклон ln r b (t)/r b (t 0 ) против (t-t 0 ) дает ω 2 s и, следовательно, s

9 9 Вклад седиментации намного больше вклада диффузии ( M> 500 кДа) Вклад седиментации сравним с вкладом диффузии (M< 100 кДа) Методсредней точки Уравнение Ламма

10 10 Решение уравнения Ламма при различных граничных условиях Граничные условия Решениe Седиментация + диффузия Аналитическое решение не существует Только седиментация Точное решение существует Только диффузия Точное решение существует Вклад седиментации сравним с вкладом диффузии Метод ван Холде-Вайшета Метод Стаффорда Численные решения (программа SEDIT)

11 11 F c + F b + F d = 0 mω 2 r (1 – ρ 0 ) = fu s u/ω 2 r = M (1 – ρ 0 )/N A f Отношение скорости частицы к ее центрифужному ускорению называется константой седиментации, s. Ее размерность секунда. s = 2S

12 12 Реальные седиментограммы белков и их смесей поглощение [OE] поглощение [OЕ] поглощение [OE] поглощение [OE]

13 13 Реальные седиментограммы белков и их смесей поглощение [OE] Белок в изолированном состоянии Смесь двух белков поглощение [OЕ] поглощение [OE] Смесь трех белков поглощение [OE] Белок в изолированном состоянии в буфере + глицерин Бычий сывороточный альбумин + глицерин Бычий сывороточный альбумин карбонгидраза + бычий сывороточный альбумин Aпо-цитохром с + карбонгидраза + бычий сывороточный альбумин

14 14 Численные решение уравнения Ламма для полидисперсных систем Программа SEDFIT (P. Shuck) Проблема устойчивости : Добавление стабилизирующего (регуляризационного) члена Наложение физически разумных ограничений на решение Проблема однозначности (вычисление молекулярной массы): Фиксированные параметры: парциальный удельный объем, плотность растворителя Подгоночные параметр: f Решение такого уравнения относится к числу некорректно поставленных задач. (dC/dt) r = –1/r {d/dr [ω 2 r 2 s C – Dr (dc/dr) t ]}t

15 15 Смесь БСА (66.4 кДа) и карбоангидразы (М= 30 кДа) Смесь БСА (66.4 кДа), карбоангидразы (М = 30 кДа) и апоцитохрома (М = 13.8 кДа) Изолированный БСА (М=66.4 кДа)

16 16 Программа SEDFIT позволяет разрешать белки в смеси, отличающиеся по молекулярной массе не менее, чем в два раза. Седиментограмма смеси двух белков, состоящей из сывороточного альбумина (M=66.3 КДa) и овальбумина. (M=42.7). Отношение молекулярных масс двух белков равно 1.55

17 17 30S M= Да 50S M= Да

18 18 Анализ очень гетерогенных систем Для анализа таких систем используется переменная скорость вращения ротора. Профиль констант седиментации для Limulus polyphemus гемоцианинового раствора (2мг/мл). Ротор фиксировался на скоростях 12, 18, 25, 35, and 50 тысячах об/мин в течение ~20 мин, исключая самую высокую скорость. (Stafford and Braswell 2004). Speed Time at s* (at 6.5 cm) (rpm) each speed (s) (svedbergs) ~

19 19 Седиментационные коэффициенты биологических макромолекул Коэффициенты седиментации биологических макромолекул очень малы. За единицу седиментации принята 1×10 –13 сек. В честь Теодора Сведберга он называется 1S. Седиментационные коэффициенты биологических макромолекул измеряются при разных условиях (температура, ионные и солевые условия) и приводятся к так называемым стандартным условиям ( вода и 20 градусов Цельсия). где s 20,w - седиментационный коэффициент приведенный к стандартным условиямi, s exp - экспериментально измеренный, η exp – вязкость растворителя при экспериментально измеренной температуре, T( o C), η 20,w – вязкость воды при 20 o C, ρ 20,w – плотность воды при 20 o C, ρ exp – плотность растворителя при данной температуре T( o C) – парциальный удельный объем молекулы..

20 20 Молекулярная масса из седиментационных и диффузионных данных s u/ω 2 r = M (1– ρ 0 )/N A f D = RT/f s/D = M(1 – ρ 0 )/RT M = s /D RT /(1 – ρ 0 ) Первое уравнение Сведберга (f D = f s ) ? Пример вычисления молекулярной массы: A macromolecule with = 0.74 cm 3 /g is sedimented in H 2 O at 20 o C; sedimentation coefficient s o 20w is 14.2 S, diffusion coefficient D o 20w = 5.82 x cm 2 /s. Calculate molecular mass.

21 21 Молекулярные массы M, константы седиментации, s 20,w, и парциальные удельные объемы ΰ биологических макромолекул, начиная от маленьких пептидов (пептид I, 2 kDa) и заканчивая большими олигомерными белками (гемоцианин, 9 MDa). Peptides and Proteins Molecular mass (in Da) Sedimentation coefficient (in Svedberg units) Partial specific volume ΰ (in cm 3 /g) 1. Small synthetic peptide I 2. Small synthetic peptide II 3. Small synthetic peptide III 5. Lipase 5 6. Insulin (dimer) 7.Cytochrome C 8. Ribonuclease A (bovine pancreas) 9. Lysozime (chicken egg white) 10. α-Lactalbumin (bovine milk) 11. Myoglobin 12. Papain 12. α-Chymotrypsin 13. Chymotrypsinogen A (bovine pancreas) 14. Elastase 15. Subtilizin BPN 16. Carboanhydrase 17. Riboflavin-binding protein 18. Carboxypeptidase 19. Pepsin

22 22 Peptides and Proteins 20. β-Lactoglobulin A, dimer (bovine milk) 21. β-lactoglobulin 22. Kinesin motor domain construct K Albumin ovum 24. Bovine serum albumin 25. Hemoglobin 26. Anthax protective antigen 26. Tropomiosin 27. Lactate dehydrogenase (dogfish) 28. β-Lactoglobulin A, octamer(bovine milk) 29. GPD, apo (bakers yeast) 30. Aldolase (Byron Mw) 31. Malate syntetase 32. Catalase (bovine liver) 33. Glutamate dehydrogenase (bovine liver) 34. Fibrinogen 35. Apoferritin 36. Apoferritin (Byron, horce spleen) 36. Urease 37. Miosin 38. Glutamate dehydrogenase 39. Hemoglobin 40. Hemocyanin Molecular mass (in Da) , , , Sedimentation coefficient (in Svedberg units) Partial specific volume (in cm 3 /g) (

23 23 Форма макромолекул из седиментационных данных s u/ω 2 r = M (1– ρ 0 )/N A f f 0 = 6π η 0 (3M/4π N A ) 1/3 S 20w 1/3 /(1 – ρ 0 ) = M 2/3 /6π η 0 N A 2/3 (3/4π) 1/3 ? s ~ M 2/3

24 24 s 0 /(1 - ρ) = n 0.47 Гомологичная серия гауссовых клубков: белки в 6М гуанидингидрохлориде или в 8М мочевине 0.47

25 25 ДНК: от жесткой палочки к гауссовому клубку s=K s M (5.4 кbp -170 кbp) s=K s M ( 200 kbp-5.4 кbp) Сравнительное гидродинамическое поведение ряда глобулярных белков и небольших фрагментов ДНК. Палочка Клубок

26 Рибосомные РНК и их фрагменты Фрагменты Нативные большие рибосомные РНК Нативные малые рибосомные РНК

27 27 Рибосомные частицы и РНК-белковые комплексы Сравнение гидродинамических характеристик РНК- белковых комплексов, моделирующих три основных домена в 30S рибосомной частице, и 30S рибосомной частицы с отрезанной головой. Три домена 16S РНК окрашены разным цветом Безголовая 30S 2/3

28 28 Седиментационное равновесие. (dC/dt)r = –1/r{d/dr[ω 2 r 2 sC – Dr(dc/dr)t]}t = 0 и следовательно D(dC/dr)t – ω 2 rCs = 0 d ln(C)/d(r 2 /2) = 1/rC dC/dr ω 2 s/D = M(1 – ρ)ω 2 /RT Тогда распределение молекул от мениска a до точки r будет подчиняться экспоненциальному закону: C(r) =C(a) exp{ω 2 M(1 – ΰ ρ 0 ) (r 2 – a 2 )/2RT}, а зависимость ln [C(r)] от r 2 /2 будет иметь вид:

29 29 Зависимость ln [C(r)] от r 2 /2 или x 2 представлена на рисунке для монодисперсного раствора (а) и полидисперсного раствора (b). Средняя молекулярная масса основана усреднении числа или массы разных компонентов в растворе. Так, если складывается число разных компонент ni, то такая молекулярная масса называется среднечисленной, Mn, и определяется как M n = N i m i /N i == n i m i Если складываются веса разных компонент m i, то такая масса называется средневесоваой, M w, и определяется как, M w = N i m 2 i /N i m i =w i m i Пример для смеси двух молекул с массами 10,000 Da and 100,000 Дa M n = 55,000 Дa, тогда как M w = Дa

30 30 Парциальный удельный объем Парциальный удельный объем молекулы есть изменение объема раствора при внесении в него одной молекулы вещества dV/dC = Он может быть >0, = 0 или

31 31 Парциальные удельные обьемы и молекулярные массы сахаров М (см 3 /г) Fructose Fucose Galactose Glucose Hexose Sucrose (0.05 M) Sucrose (0.15 M) Sucrose (1 M) Raffinose (25 o C) Парциальные удельные обьемы и молекулярные массы аминокислот М ύ (см 3 /г) Glycine Alanine Serine Threonine Valine Leucine Isoleucine Proline Methionine Phenylalanine Cystine Tryptophan Tyrosine Histidine Arginine Lysine Aspartic acid Glutamic acid Glutamine Asparagine Средние величины парциальных удельных обьемов четырех типов биологических макромолекул (cm 3 /г) Proteins 0.73 ( ) Carbohydrates 0.61 ( ) RNA 0.54 ( ) DNA 0.57 ( ) Расчет величин парциальных удельных обьемов биологических макромолекул ΰ 1.2- = ύ 1 м 1 /(м 1 +м 2 ) + ΰ 1 м 2 /(м 1 +м 2 ) Рибосома!!

32 32 Парциальный удельный объем белка в настоящее время вычисляется по его химическому составу с помощью программы SEDNTEP (Harpaz et al., 1994) Парциальный удельный объем белка может быть рассчитан из парциальных удельных объемов составляющих его аминокислотных остатков по аддитивной формуле (Cohn and Edsall, 1943) ύ = i ύ W i / i W i где W i весовая доля, а ύ i парциальный удельный объем i th остатка.

33 33 Седиментация в градиенте плотности Скоростная седиментация в градиенте плотности сахарозы Равновесная седиментация в градиенте плотности CsCl Опыты Месселсона-Сталя по доказательству полуконсервативного механизма редупликации ДНК

34 34 Опыты Месселсона-Сталя по механизму редупликации ДНК Эксперимент Клетки E. coli параллельно выращиваются на среде, содержащей легкий и тяжелый изотопы азота 14 N и 15 N. Затем клетки, выращенные на одной из сред, переносятся на другие среды. Выделенная из клеток ДНК анализируется методом равновесной седиментации в градиенте плотности Рассуждение Эксперимент