МОЛЕКУЛЯРНОЕ СТРОЕНИЕ ОПЕРОНА План Генетическая система координат. Строение оператора и промотора 1.Структура транскрибируемой области оперона. Терминация. - презентация

1 МОЛЕКУЛЯРНОЕ СТРОЕНИЕ ОПЕРОНА План Генетическая система координат. Строение оператора и промотора 1.Структура транскрибируемой области оперона. Терминация транскрипции. Результат транскрипции. 2.Регулоны и аттенюаторы 3.Молекулярный механизм работы белка- репрессора

2 1. Генетическая система координат. Строение оператора и промотора Методами молекулярной биологии в 70 х годах была подтверждена оперонная гипотеза Ф. Жакоба и Ж. Моно (удостоенных Нобелевской премии в 1965 году) и установлено строение оперона (рис.1). Оказа- лось, что оператор – это участок ДНК, находящийся в самом начале транскрибируемой области оперона. Перед оператором (в нетранскрибируемой области) находится регуляторный участок - промотор. Промотор – это область ДНК, к которой прикреп- ляется молекула фермента РНК-полимеразы.

3 Строение оперона Рис. 1. Молекулярное строение и схема экспрессии оперона: а принципиальная структура гена (р промотор; СР сайт связывания рибосом; ИК и ТК соответственно инициирующий и терминирующий кодоны; t терминатор транскрипции) ; б - идеализированная структура характерных сайтов на некодирующей нити ДНК; в - мРНК; г - белок- предшественник ; д активный белок.

4 На рисунке 1 использована принятая в молекулярной гене- тике система координат, в которой нуклеотиды нумеруются от границы между транскрибируемой (справа) и нетранскри- бируемой (слева) областями ДНК. Первый транскрибируемый нуклеотид и все нуклеотиды, находящиеся от него справа, имеют номера со знаком (+). Нетранскрибируемые нуклеотиды нумеруются влево со знаком (–). Другая особенность схемы состоит в том, что состав нук- леотидов указывается не по смысловой, а по комплементарной ей цепи ДНК. Это облегчает отображение результатов транс- крипции, так как синтезируемая РНК имеет такой же состав нуклеотидов, что и несмысловая цепь ДНК (за исключением замены тимина на урацил). Оператор в этой системе координат находится на отрезке ДНК от +1 до +24, промотор – от –1 до –38. (Эти значения являются усреднёнными по большому числу (свыше 100) изученных промоторов E. coli).

5 В состав промоторов всех изученных оперонов входят два участка с относительно постоянным составом и последовательностью нуклеотидов (консервативные последовательности). Одна из них (последователь- ность Хогнесса) необходима для узнавания, а другая (последовательность Прибноу) – для тесного связыва- ния РНК-полимеразы с промотором. Последовательность Хогнесса имеет состав 5ТТГАЦА3. Её центр находится около координаты – 35. Последовательность Прибноу (5ТАТААТ3) расположена в участке с центральной координатой –10. В разных промоторах положение обоих последовательностей немного различается. Чаще всего они отстоят друг от друга на пар нуклеотидов.

6 Последовательность нуклеотидов оператора (область ДНК от +1 до +24). лактозного оперона (Lac-оперона) образует симметричный палиндром (рис. 2) – после- довательность пар нуклеотидов, которая в каждой из цепей ДНК считывается одинаково, но в противо- положных направлениях (как справа налево, так и сле- ва направо). Строение палиндрома таково, что моле- кула белка-репрессора, закодированного в регулятор- ном гене (I*), прочно связывается с изолированной ДНК оператора (если нет индуктора). Если же в среде есть индуктор (аллолактоза), то репрессор соединяется с ним. При этом происходит аллостерическое измене- ние пространственной структуры молекулы репрессо- ра, что влечёт к ослаблению его связи с операторной ДНК.

7 Рис. 2. Белок-репрессор и нуклеотидная после- довательность ДНК (палиндром), с которой связывается с lac-репрессор.

8 2. Структура транскрибируемой области оперона. Терминация транскрипции. Результат транскрипции Транскрибируемая область оперона включает не только опе- ратор и структурные гены. Между оператором и первым струк- турным геном (координаты от +28 до +36) находится участок, кодирующий т.н. сайт узнавания рибосом (или последо- вательность Шайна-Далгарно) (СР на рис.1). В её состав вхо- дит участок 5АГГА 3. В транскрибируемой мРНК к этой последовательности присоединяется рибосома. Сайты рибосом расположены перед каждым структурным геном оперона. Промотор, оператор и терминирующий участок являются общими для всех генов оперона. Поэтому, синтезирующаяся мРНК является полицистронной, т.е. содержит непрерывную последовательность нуклеотидов РНК, транскрибированную со всех структурных генов данного оперона – от оператора до терминатора включительно.

9 Примерно с 37-го нуклеотида начинается ДНК первого структурного гена. Первый триплет (кодон в мРНК) называется инициирующим (ИК на рис.1). В большинстве генов бактерий это триплет АТГ (реже – ГТГ). Триплет АТГ кодирует ами- нокислоту метионин, но в начале полипептидной цепи он оп- ределяет вставку аминокислоты – формилметионина. В гото- вом белке эта аминокислота модифицируется или отщепляется. Белок-кодирующая часть заканчивается терминирующим триплетом (ТК на рис.1) (ТАА, ТАГ или ТГА). Пройдя структурные гены и синтезировав полицистронную молекулу мРНК, РНК-полимераза вступает в область, назы- ваемую терминатором. В терминаторной последовательности содержатся участки, состоящие из повторяющихся ГЦ-пар, расположенных в противоположной ориентации относительно друг друга и взаимно комплементарных. В транскрибиро- ванной одноцепочной мРНК эти участки комплементарно соединяются друг с другом с помощью водородных связей, образуя т.н. «шпильки» (рис. 3).

10 Предполагается, что образование шпилек в синтезированной моле- куле мРНК способствует её отсо- единению от ДНК-матрицы. Движение РНК-полимеразы по двойной нити ДНК сопровож- дается перемещением расплав- ленного участка ДНК (дли-ной н.п.), в котором 3-концевая область синтезируемой мРНК свя- зана водородными связями с ДНК-матрицей. После считывания терминаторного участка в соот- ветствующем ему участке мРНК образуется шпилька. Это, каким то, пока не образом, ослабляет связь РНК с ДНК матрицей и приводит к разрыву водородных связей между ними. Рис. 3. Шпильки в термина- торных последовательностях двух мРНК, образующиеся при транскрипции: 1 - гена фага λ; 2 -триптофанового оперона E.coli

11 За терминатором, на рассто- янии около 20 нуклеотидов от оси шпильки, расположен уча- сток ДНК, состоящий из остат- ков тимидина (ТТТ…) (в мРНК, соответственно, УУУ…). На РНК-транскрипте образуется полиуридиновый «хвост» (рис. 1, 4). Так как поли-У последо- вательность соединена с ком- плементарной ей последова- тельностью поли-А (в ДНК) меньшим числом водородных связей, чем участки, состоящие из Г-Ц пар, то это способствует отсоединению РНК-транс- крипта от ДНК-матрицы. Рис. 4. Возможный механизм терминации транскрипции (объяснение в тексте).

12 На рис. 5 показана схема экспрессии лактозного оперона E.coli. Образовавша- яся в ходе транс- крипции полигенная (полицистронная) молекула мРНК, состоит из лидерной (5), белок-кодирую- щей и концевой (3) частей. Рис. 5. Схема экспрессии лактоз- ного оперона E.coli: а – строение оперона (р – промотор; о – опе- ратор; Z, Y, A – структурные гены; t – терминатор); б – полигенная мРНК (СР- сайт связывания рибосом, ИК и ТК – инициирующий и терминирующий кодоны); в - белки.

13 Трансляция мРНК начинается с посадки рибосом на мРНК, которая осуществляется благодаря комплементарности 3–конца 16S рибосомной РНК и лидерной части мРНК (в сайте связывания рибосом). Рибосомы считывают информацию со всех генов полигенной мРНК. Но благодаря тому, что перед каждым геном имеется свой сайт связывания рибосом и инициирующий кодон, а в конце каждого гена – свой терминирующий кодон, на каждом гене мРНК синтезируется своя отдельная полипептидная цепь (рис.5).

14 3. Регулоны и аттенюаторы В ДНК бактерий существует и другой тип организа- ции генов. Некоторые группы структурных генов объ- единены в регулоны – совокупности координирован- но экспрессирующихся генов, контролирующих одну определенную функцию (этапы расщепления или син- теза какого-либо вещества). Гены в регулоне прост- ранственно отдалены друг от друга. Каждый ген имеет собственные промотор, оператор и терминатор транс- крипции. В некоторых регулонах часть генов объеди- нена в опероны (например аргининовый регулон состоит из шести отдельных генов и двух оперонов). Некоторые опероны (и регулоны), контролирую- щие синтез аминокислот, содержат ещё один тип регуляторных элементов – аттенюаторы.

15 Аттенюатор – это нуклеотидная последовательность с инвертированными повторами, расположенная между промотором и первым геном оперона. Вторичная структура аттенюатора изменяется в зависимости от наличия или отсутствия в клетке аминокислоты, синтез которой контролируется данным опероном (или регулоном). В аттенюаторе закодирован пептид, содержащий несколько, расположенных друг за другом, аминокислотных остатков данной аминокислоты. Когда концентрация аминокислоты в клетке в результате её синтеза (или поступления извне) достаточно высокая, происходит синтез аттенюаторного пептида. В результате изменяется вторичная структура ДНК в аттенюаторе таким образом, что транскрипция оперона прекращается. (Аттенюатор, таким образом, приобретает характер терминатора). При низкой концентрации аминокислоты в клетке пептид не синтезируется и структура аттенюатора не мешает транскрипции.

16 4. Молекулярный механизм работы белка-репрессора Молекула активного Lac-репрессора это тетрамер, постро- енный из четырёх одинаковых полипептидных цепей (рис.2), первичная структура которых закодирована в гене-регуляторе (I*). Каждая цепь состоит из 360 аминокислотных остатков. Репрессор способен соединяться как с операторной ДНК, так и с индуктором. Связывание с этими двумя агентами осущест- вляется двумя различными участками белковых цепей моле- кулы репрессора. К ДНК репрессор прикрепляется N-концевой последовательностью, длиной около 50 аминокислотных остат- ков. Соединение с индуктором так изменяет конфигурацию молекулы репрессора, что она теряет химическое сродство к операторному участку ДНК. Для репрессии транскрип- ции Lac-оперона достаточно 10 молекул репрессора на клетку.),

17 Удивительна точность, с которой молекула репрессора «опознаёт» операторный участок. Длина молекулы ДНК E. coli составляет 3,2 млн. пар нуклеотидов, а длина оператора Lac- оператора – всего 24 п.н. (рис.2). Если использовать иной масштаб, и принять длину оператора равной 1 см, то длине всей ДНК будет соответствовать величина 1,33 км. Каким образом нескольким молекулам репрессора удаётся «отыс- кать» на огромной молекуле ДНК свою крошечную операторную последовательность? Успешность столь точного поиска определяется его механизмом. Молекулы репрессора имеют достаточно сильное химическое сродство и к неоператорной ДНК. По-видимому, все они после своего синтеза прикрепляются к ДНК в любом месте. Но эта связь, примерно, в раз слабее связи со своим оператором.

18 Она достаточно сильна, чтобы удерживать молекулы репрес- сора в постоянном контакте с нитью ДНК, но позволяет им перемещаться (скользить) вдоль ДНК (рис.6). Встретившись при таком скольжении со своим оператором, белок-репрессор прочно фиксируется на нём. Моделью данного процесса может служить бусина, нани- занная на длинную нить. Она может свободно перемещаться по нити, пока не наткнётся на крупный узелок. Рис.6. Схема поиска белком- репрессором области оператора на ДНК бактерии, сплетённой в клубок – нуклеоид. (Объяснение в тексте)

19 Поиск оператора молекулами репрессора облегчается благодаря особенностям строения как самого репрессора, так и операторного участка ДНК. Оператор имеет структуру палиндрома (рис.2), поэтому он может одинаково хорошо «распознаваться» молекулой репрессора при подходе к нему как слева, так и справа.), Молекула репрессора также симметрична, её противоположные концы одинаковы по строению, а, следовательно, обладают одинаковыми способностями к «распознаванию» оператора. Поэтому молекула репрессора может перемещаться по кольцевой «хромосоме» бактерии в любом направлении. В любом случае, она «обнаружит» свой оператор и прочно соединится с ним.

20 Вопросы и задания 1. Нарисуйте в тетради схему строения оперона (рис.1). Выде- лите и подпишите названия всех его функциональных участков. 2. Какие последовательности называются консервативными? Каковы функции последовательностей Прибноу, Хогнесса и Шайна-Долгарно? 3. Какой белок закодирован в гене регуляторе? Каковы фун- кциональные и структурные особенности этого белка? 4. Что такое палиндром? Какова его функция в промоторном участке оперона? 5.Каким образом молекула белка-репрессора «узнаёт» операторный участок в опероне? 6. Каким образом образуются «шпильки» в терминаторном участке иРНК? Какова их возможная функция? 7. Что такое аттенюатор? Какова его функция?