Руководитель отдела научно-исследовательских биотехнологий компании «Адвенсум» Никоненко Татьяна Александровна, к.б.н. Руководитель отдела научно-исследовательских. - презентация

1 Руководитель отдела научно-исследовательских биотехнологий компании «Адвенсум» Никоненко Татьяна Александровна, к.б.н. Руководитель отдела научно-исследовательских биотехнологий компании «Адвенсум» Никоненко Татьяна Александровна, к.б.н. Основные задачи, решаемые лабораторией клеточных технологий, и принципы ее организации

2 Основные задачи, решаемые клеточной лабораторией Культивирование клеток - метод, позволяющий сохранять жизнеспособность клетки и выращивать клетки, ткани, небольшие органы (или их части) животнего, включая человека, или растения вне организма на/в питательной среде. Культура клеток представляет собой гомогенную популяцию генетически однородных клеток, растущих в постоянных условиях.

3 Основные задачи, решаемые клеточной лабораторией Получение первичной культуры клеток Первичная культура клеток клетки, получаемые из тканей или биологических жидкостей животнего/человека и поддерживаемые в культуре до первого субкультивирования (пересева). Первичная культура кардиомиоцитов неонатальных крыс.

4 На I этапе получения первичной культуры происходит стерильное удаление фрагмента ткани животнего и его механическая или ферментативная (трипсином или коллагеназой) дезинтеграция. Мелкие кусочки прикрепляются к поверхности чашки благодаря собственной адгезивности, наличию насечек на чашке или с помощью сгустка плазмы. В этих случаях будет происходить рост клеток из фрагментов, и клетки, мигрирующие из эксплантатов, могут использоваться для пассирования. (Таким образом, например, можно получать культуру клеток дермы - фибробластов. ) Клетки образующейся при этом суспензии оседают, прикрепляются и распластываются на поверхности стекла или пластика. Основные задачи, решаемые клеточной лабораторией Первичная культура клеток.

5 Большинство клеток млекопитающих могут расти только будучи прикреплёнными к субстрату: к другим клеткам (т.н. клеткам фидернего слоя), к различным матриксам (коллагену, малинину, фибронектину и т.п.), к стеклу или к пластику. Хотя для определенных целей используют также культивирование клеточной суспензии. Прикрепление клетки к субстрату. Основные задачи, решаемые клеточной лабораторией Первичная культура клеток. Прикрепление к субстрату

6 Субкультивирование первичной культуры. После того, как первичная культура достигнет состояния монослоя, она может быть перенесена во второй культуральный сосуд после диссоциации клеток монослоя трипсином и разведения - т.е. пересеяна или субкультивирование. Для суспензионных культур в случае субкультивирования достаточно только разведения. Процесс образования монослоя можно наблюдать в инвертированный микроскоп. Основные задачи, решаемые клеточной лабораторией Субкультивирование первичной культуры.

7 Основные задачи, решаемые клеточной лабораторией Рассев и кормление клеточной культуры. Как определить, что клеточную культуру пора рассевать? клетки образуют плотный монослой индикаторный краситель Phenol Red (феноловый красный)меняет цвет с ярко-краснего в свежей среде до желто-оранжевого в среде с культивируемыми в течение некоторого времени клетками

8 Основные задачи, решаемые клеточной лабораторией Пересев и оценка жизнеспособности клеточной культуры. В процессе пересева после трипсинизации можно оценить состояние клеточной культуры: подсчитать общее количество клеток, и в их числе мертвые и живые клетки. Для этих целей существует простой метод подсчета клеток в гемоцитометре (камере Горяева) или в автоматизированных счетчиках клеток. Принцип подсчета: в клеточную суспензию добавляют равный объем 0,1%-него трипанового синего - он окрашивает только мертвые клетки.

9 Основные задачи, решаемые клеточной лабораторией Создание клеточных линий - ограниченных и постоянных Клеточная линия - культура однородных клеток, обладающих определенными и относительно постоянными свойствами и характеристиками. Ограниченные клеточные линии живут определённое количество пассажей, а потом культура отмирает. Ограниченная клеточная линия может также "трансформироваться " и превращаться в постоянную клеточную линию. Пока неясно, возникают стволовые клетки постоянной культуры в ходе пассирования или они пред существуют в замаскированной форме в популяции клеток ограниченной линии. Также можно предположить мутационную природу их появления (хромосомные перестройки, траслокации, частичное или полное не спаривание или точечные мутации).

10 Основные задачи, решаемые клеточной лабораторией Трансформация и дифференцировка клеточной культуры. Перерождение клеток характеризуется следующими особенностями: морфологическими изменениями (мельчание или укрупнение, уменьшение адгезивной способности, увеличение ядра); укорочением клеточнего цикла (время удвоения уменьшается до 12 часов, обычно ); уменьшением зависимости клеток от добавления сыворотки; нетребовательностью к качеству субстрата; увеличением потенции к образованию опухолей. Среди множества трансформированных клеточных линий одной из самых известных является HeLa.

11 Основные задачи, решаемые клеточной лабораторией Транспортировка и хранение клеточной культуры. Незамороженые клетки можно транспортировать в виде монослоя либо в сосуде, содержащем лишь следы культуральной среды, либо в сосуде, полностью наполненном средой. Сосуды должны быть прочно закупорены во избежание испарения среды, и внешняя температура при транспортировке не должна выходить из диапазона 10-37С. Этот метод транспортировки пригоден только для небольших расстояний. Для транспортировки на большие расстояния культуры клеток замораживают в жидком азоте, а транспортируют их замороженными в твердой углекислоте. Поскольку клетки обладают низкой жизнеспособностью при температуре сухого льда, то сразу после получения их следует использовать или пере заморозить в жидком азоте. Хранение клеточных культур в осуществляется в жидком азоте в специальных емкостях - сосудах Дьюара.

12 Работа в клеточной лаборатории состоит из следующих основных этапов Работа в клеточной лаборатории состоит из следующих основных этапов III Научные исследования в области генетики, иммунологии, протеомики, физиологии, эмбриологии III Научные исследования в области генетики, иммунологии, протеомики, физиологии, эмбриологии II Выделение, культивирование, дифференцировка клеток I Забор крови, тканей, костнего мозга, биологических жидкостей I Забор крови, тканей, костнего мозга, биологических жидкостей IV Замораживание, хранение и витрификация клеточных культур IV Замораживание, хранение и витрификация клеточных культур Основные этапы работы в клеточной лаборатории

13 Культуральный бокс – основная единица организации пространства клеточной лаборатории Боксовое помещение представляет собой: 1. изолированную комнату; 2. с несорбирующими пыль моющимися покрытиями; 3. имеющую предбоксник; 4. обеспеченную необходимым общим и специальным освещением; 5. системами приточной и вытяжной вентиляции; 6. холодным и горячим водоснабжением; 7. подводами газов и сжатого воздуха.

14 Схема организации помещения культуральнего бокса ламинар II класса биологической безопасности 2 - СО 2 -инкубатор 3 - шкаф с посудой и пластиком для культуральных работ 4 - стол с инвертированным световым микроскопом 5 - холодильник с культуральными средами и реагентами для клеточных работ 6- предбоксник с рабочей одеждой

15 Организация пространства клеточной лаборатории Ламинарный шкаф Функции: Обеспечение стерильности и предотвращение контаминации при работе с клеточными культурами 1. Включение/ выключение потока воздуха. 2. Включение/ выключение света или ультрафиолета. 3. Регулировка скорости потока стерильнего воздуха с задней стенки ламинара. 4. Лампа дневнего света и ультрафиолетовая лампа. 5. Задняя стенка с фильтром, через которую осуществляется подача стерильнего воздуха (поток стерильнего воздуха идет в лицо работающему). 6. Стол ламинара с металлической поверхностью (протирается перед работой спиртом, на ночь включается ультрафиолетовая лампа).

16 СО 2 инкубатор 1 - двойная дверь, 2 - панель управления подачей СО мнегофункциональное цифровое табло 4 - ручка переключения регулируемых параметров 5 - панель управления регулируемыми параметрами (температура); Cтрелка указывает на баллоны с СО 2. Функции: поддержание влажности (внутрь инкубатора ставится емкость с водой с обеззараживающими добавками, например медным купоросом) Поддержание уровня СО 2 При выращивании клеток в посуде типа чашек Петри и пластиковых планшетов клеткам необходим 5 5% содержание СО 2. Поддержание температурнего режима (37 градусов Цельсия) Организация пространства клеточной лаборатории СО 2 инкубатор

17 Микроскоп инвертированный - это оптический микроскоп, у которого объектив располагается под наблюдаемым предметом, а конденсор - сверху. Такой микроскоп позволяет рассматривать объект снизу. В биологии и медицине с помощью таких микроскопов изучают культуры клеток, прикрепленные ко дну культуральной посуды. Инвepтиpoвaнныe микpocкoпы идeaльны для caмoгo шиpoкoгo pядa иccлeдoвaний: в физиoлoгии, электрофизиологии, при paбoтe c тканями, клeтoчными культуpaми, в ЭKO. Организация пространства клеточной лаборатории Микроскоп инвертированный

18 Соединяют в себе функционал ламинарнего шкафа + инкубатора + микроскопа для наращивания клеточных культур в автоматическом режиме Автоматизирует одновременное наращивание нескольких десятков клеточных линий с разными протоколами культивирования, для исследований и скрининга наращивание аутологических клеточных продуктов от нескольких десятков пациентов пересев и сбор клеток в асептических условиях без риска перезаражения транзиторную трансфекцию одновременную инкубацию нескольких сотен культуральных планшетов / флаконов подсчет количества и жизнеспособности клеток работу с мнегослойными флаконами рассев клеток в планшеты для последующего скрининга Востребованы: в сложных программах культивирования клеточных линий в онкологических программах, при исследовании стволовых клеток, при изучении токсичности разрабатываемых фармпрепаратов (преклинические испытания) в наработке клинического материала при проведении II и III фазы клинических исследований званий в коммерческом производстве аутологических продуктов клеточной терапии Соединяют в себе функционал ламинарнего шкафа + инкубатора + микроскопа для наращивания клеточных культур в автоматическом режиме Автоматизирует одновременное наращивание нескольких десятков клеточных линий с разными протоколами культивирования, для исследований и скрининга наращивание аутологических клеточных продуктов от нескольких десятков пациентов пересев и сбор клеток в асептических условиях без риска перезаражения транзиторную трансфекцию одновременную инкубацию нескольких сотен культуральных планшетов / флаконов подсчет количества и жизнеспособности клеток работу с мнегослойными флаконами рассев клеток в планшеты для последующего скрининга Востребованы: в сложных программах культивирования клеточных линий в онкологических программах, при исследовании стволовых клеток, при изучении токсичности разрабатываемых фармпрепаратов (преклинические испытания) в наработке клинического материала при проведении II и III фазы клинических исследований званий в коммерческом производстве аутологических продуктов клеточной терапии Новое в организации пространства клеточной лаборатории - автоматизированные системы для наращивания клеточных линий

19 Работа в клеточной лаборатории состоит из следующих основных этапов Работа в клеточной лаборатории состоит из следующих основных этапов III Научные исследования в области генетики, иммунологии, протеомики, физиологии, эмбриологии III Научные исследования в области генетики, иммунологии, протеомики, физиологии, эмбриологии II Выделение, культивирование, дифференцировка клеток I Забор крови, тканей, костнего мозга, биологических жидкостей I Забор крови, тканей, костнего мозга, биологических жидкостей IV Замораживание, хранение и витрификация клеточных культур IV Замораживание, хранение и витрификация клеточных культур Основные этапы работы в клеточной лаборатории

20 Системы забора крови Гомогенизаторы тканей Центрифуги Холодильники Стерилизаторы Фильтрационные системы Системы забора крови Гомогенизаторы тканей Центрифуги Холодильники Стерилизаторы Фильтрационные системы Оборудование для оснащения клеточных лабораторий ЭТАП I – забор материала и пробоподготовка

21 Ламинарные шкафы (II класса биологической защиты ) СО 2 инкубаторы Холодильники Центрифуги ультрацентрифуги Инвертированные микроскопы Счетчики клеток Культуральный пластик, среды, расходные материалы Автоматизированные системы для выделения/ наращивания клеток Ламинарные шкафы (II класса биологической защиты ) СО 2 инкубаторы Холодильники Центрифуги ультрацентрифуги Инвертированные микроскопы Счетчики клеток Культуральный пластик, среды, расходные материалы Автоматизированные системы для выделения/ наращивания клеток Оборудование для оснащения клеточных лабораторий ЭТАП II – выделение, рассев, дифференцировка, наращивание первичных культур и линий клеток

22 Системы наблюдения за живыми клетками в культуре Микроскопы исследовательского класса с манипуляторами Системы сверхточной лазерной микродиссекции Программно- технические комплексы для автоматизации научных исследований в области генетики Системы наблюдения за живыми клетками в культуре Микроскопы исследовательского класса с манипуляторами Системы сверхточной лазерной микродиссекции Программно- технические комплексы для автоматизации научных исследований в области генетики Оборудование для оснащения клеточных лабораторий ЭТАП III – научные исследования

23 Криозамораживатели Криохранилища Сосуды Дьюара Морозильники низкотемпературные Криозамораживатели Криохранилища Сосуды Дьюара Морозильники низкотемпературные Оборудование для оснащения клеточных лабораторий ЭТАП IV – замораживание и хранение

24 Программно-технические комплексы для автоматизации научных исследований биологических объектов в области генетики Выполняют задачи автоматического выделения ДНК/РНК из различных образцов проведения оценки качества образцов нуклеиновых кислот проведения ПЦР изучения генетических полиморфизмов генетической трансформации и изучения функций генов снятия изображений и анализа данных Оборудование для оснащения клеточных лабораторий ЭТАП III – научные исследования

25 Цитометр NyONE и Cellavista (Synentec GmbH, Германия) Возможности применения: Клонирование единичной клетки Анализ слияния Подсчет клеток Анализ клеточной пролиферации Тест на жизнеспособность клеток Оптимизация культуральной среды Эффективность трансфекции Определение CD маркеров, антител, секреции клетки Используется для проведения научных и скрининговых исследований : в научно-исследовательских лабораториях (стволовых клеток, онкологии, токсикологии) в лабораториях клеточной терапии в лабораториях онкологических клиник ( при создании противоопухолевых дендритных вакцин) в лабораториях ЭКО (контроль развития эмбрионов) в лабораториях регенеративной медицины в фармакологических лабораториях. Оборудование для оснащения клеточных лабораторий ЭТАП III – научные исследования

26 Цитометры JULI BR и JULI FL (NanoEnTek, Корея) Формат расходных материалов – слайды-камеры Возможности применения: Визуализация живых клеток Мониторинг роста клеток Анализ клеточной миграции, слияния клеток Контроль качества клеточной культуры Развитие стволовых клеток Оптимизация культуральной среды Эффективность трансфекции Все тесты проводятся in vivo Целевая аудитория: научно-исследовательские лаборатории лаборатории клеточной терапии лаборатории онкологических клиник токсикологические лаборатории Оборудование для оснащения клеточных лабораторий ЭТАП III – научные исследования

27 Приборы для криоконсервации и криохранения. -- Программные замораживатели -- Клеточные криохранилища с функцией программнего замораживания клеточнего материала -- Автоматизированные хранилища биоматериала и проб нуклеиновых кислот (до -80 о С) (Brooks/) -- Низкотемпературные холодильники для хранения биологического материала, (до -80 о С) - Аппарат для подготовки стволовых клеток к криоконсервации Coolmix Расходные материалы - контейнеры для обработки и хранения замороженнего клеточнего материала Целевая аудитория: Клеточные лаборатории клеточной (аутологической/ донорской) терапии; клиники регенеративной медицины банки пуповинной крови; клеточные банки. ЭТАП IV – замораживание и хранение

28 Низкотемпературные хранилища Brooks Biostore II (-80°C). Brooks 80°C BioStore II это автономная, полностью автоматизированная система хранения и извлечения образцов, способная поддерживать температуру биоматериала на заданном уровне в течение всего срока хранения. Система предназначена для хранения: -тканей, -плазмы, -сыворотки, -цельной крови, -нуклеиновых кислот, -фармсубстанций. Хранилище модульнего типа вмещает от 1,5 до 5,5 млн. пробирок объемом 0,5 мл. Целевая аудитория: -биобанки ЭТАП IV – замораживание и хранение

29 Клеточные процессы, связанные с регенерацией миокарда, долгое время считались невозможными. Однако недавно было установлено, что во всех возрастных периодах сердце содержит пул делящихся малодифференцированных клеток - предшественников кардиомиоцитов. В терминальной стадии ХСН, а также при острых состояниях миокарда, например при инфаркте, количество таких клеток значительно увеличивается. Эти клетки были названы резидентными кардиальными прогениторными клетками и охарактеризованы по экспрессируемым маркерным белкам. Регенерация миокарда Пример актуальнего исследования, проводимого в клеточной лаборатории

30 Резидентные прогениторы кардиомиоцитов в эндомиокардиальном биоптате пациента с дилатационной кардиомиопатией. C-kit- маркер стволовых клеток наложение c-kit и Nkx2.5 (локализация на мембране) Nkx2.5 – маркер ранней окрашивание на DAPI- дифференцировки кардиомиоцитов локализация клеточнего ядра (локализация внутри ядра)

31 Резидентные прогениторные клетки могут быть лучшими кандидатами для применения в клеточной терапии сердца, так как они являются тканеспецифичными, прекоммитированными и обладают большой способностью к дифференцировке. Получение резидентных прогениторов кардиомиоцитов из эндомиокардиальных биоптатов (ЭМБ) пациентов, их наращивание и дифференцировка в культуре дает возможность вводить эти клетки тем же пациентам, что поможет избежать побочных эффектов, связанных с использованием неаутологичных клеток. Дальнейшая дифференцировка этих клеток в зрелые кардиомиоциты могла бы привести к улучшению функциональных характеристик миокарда при развитии хронической сердечной недостаточности. (Фотографии были любезно предоставлены доктором О.В. Степановой, НИИКК, РКНПК, Москва.) Регенерация миокарда Пример актуальнего исследования, проводимого в клеточной лаборатории

32 БЛАГОДАРЮ ЗА ВНИМАНИЕ! Руководитель отдела Научно-исследовательских биотехнологий Никоненко Татьяна Александровна, к.б.н. Никоненко Татьяна Александровна, к.б.н.