Магистрант Мухортова Анна Научный руководитель вед. науч. сотр., канд. биол. наук Горудко Ирина Владимировна 1

2 запуск сигнализации формирование функционального ответа Лектин (ConA) Взаимодействие лектинов с нейтрофилами в липидных рафтах – участках плазматической мембраны, богатых холестерином, гликосфинголипидами и насыщенными фосфолипидами нейтрофил

3 Ведет к изменению функциональных свойств нейтрофилов 1) вследствие модификации трансмембранной трансдукции сигнала (разрушение липидных рафтов) 2) из-за изменения свойств и функционирования различных мембранных белков и их комплексов (модификация механических свойств и вязкость мембраны)

Цель работы – выявление роли холестерина в процессах формирования функциональных свойств нейтрофилов при действии лектинов различной углеводной специфичности. Метод : 1) экстракция части холестерина из плазматической мембраны при помощи циклодекстринов и 2) изучение изменения в клеточных ответах Циклодекстрины – циклические олигомеры глюкозы, содержащие 6-8 мономеров в кольце. MβCD – метил-β-циклодекстрин. Инкубирование в 10 мМ растворе MβCD 10 минут – 48% выход холестерина 4 Переход Агрегация ГенерацияДегрануляция

Необходимо, чтобы обработка нейтрофилов CD приводила к вымыванию из них холестерина без нарушения жизнеспособности клеток 5 Выход холестерина (% относительно общего выхода холестерина после обработки клеток 0,1% Тритоном Х-100): инкубирование в 15 мМ CD 15 мин - 31% инкубирование в 10 мМ M CD 10 мин - 48% Жизнеспособность клеток при такой обработке практически не изменялась: активность ЛДГ после обработки CD - 12,4% активность ЛДГ после обработки M CD - 10,4% активность ЛДГ в контроле - 12,9% (% от активности общего количества фермента ЛДГ после обработки клеток 0,1% Тритоном Х-100)

Аббревиа- тура Латинское название лектинов Происхождение Углеводная специфичность WGATriticum aestivum L.Зародыши пшеницы Сиаловая кислота, GlcNAc UDAUrtica diooca L.Корневища крапивыGlcNAc SBAGlycine hispida L.Семена соиD-галактоза Con ACanavalia ensiformis L.Семена канавалии мечевидной D-глюкоза, D-манноза LVALeucojum vernum L.Трава белоцветика весеннего Олигомеры маннозы PNAArachis hypogaea L.Семена арахисаβ,1-3-галактозо-N-ацетил-D- галактозамин СABACaragana arborescens L.Кора караганды древовиднойGlcNAc VAAViscum Album L.Омела белаяD-галактоза PHA-L Phaseolus vulgaris L. Лейкоаглютинин семян фасоли обыкновенной D-галактоза, манноза, GlcNAc PHA-E Phaseolus vulgaris L. Эритроглютинин семян фасоли обыкновенной β,1-4-глюкозо-N-ацетил-β- манноза, β,1-3-галактозо-N- ацетил-D-галактозамин VSAVicia sativa L.Семена вики посевнойD-глюкоза, D-манноза SNASambucus nigra L.Кора бузины чернойN-ацетил-D-лактозамин, лактоза 6

7 80 µm Контроль M CD Кинетические кривые WGA-индуцированной агрегации нейтрофилов в отсутствие (1) и присутствие (2) MβCD. Контроль (1) – агрегаты, образованные при добавлении WGA (7,5 мкг/мл) к суспензии нейтрофилов в PBS; MβCD (2) – WGA-индуцированные агрегаты нейтрофилов, предварительно инкубированных в течение 10 мин при 37°С в присутствии MβCD (10 мМ).

8 Кинетические кривые интенсивности флуоресценции скополетина в суспензии контрольных (1) и ConA-активированных нейтрофилов в отсутствие (2) и в присутствии MβCD (10 мМ) (3). Нейтрофилы инкубировали в течение 10 мин при 37 0 С в присутствии MβCD (10 мМ), до внесения Con A (20 мкг/мл) Лаг-период Скорость генерации Н 2 О 2

9 Влияние МβCD на ConA-индуцированную дегрануляцию нейтрофилов. Нейтрофилы инкубировали в течение 20 мин при 37 0 С в отсутствии и в присутствии MβCD (10 мМ) до внесения ConA (50 мкг/мл) Предположение

10 h 2 мкм Необработанные (интактные) нейтрофилы: h 2 мкм, d h/2 7 мкм выражено ядро присутствуют филоподии Нейтрофилы с пониженным содер-жанием холестерина: h 0,9 мкм, d h/2 9 мкм не выражено ядро сглаженная поверхность, отсутствуют филоподии Предположение: Экстракция холестерина при помощи MβCD приводит к нарушению взаимосвязи мембраны с цитоскелетом

11

12

Установлено, что при действии большинства рассмотренных лектинов снижается степень агрегации и увеличивается лаг-период активации НАДФН-оксидазы нейтрофилов с пониженным содержанием холестерина. Предполагается, что холестерин вовлечен в процессы латерального перемещения и сборки мембранных рецепторов, участвующих в лектин-индуцированных процессах – формировании межклеточных контактов и активации НАДФН-оксидазной системы нейтрофилов. Специфическое углевод-опосредованное увеличение продукции Н 2 О 2 нейтрофилами в присутствии циклодекстринов в ответ на действие таких лектинов как PHA-L, ConA, PHA-E, WGA, UDA и CABA может быть следствием увеличения лектин-индуцированной секреторной дегрануляции клеток. Лектины с одинаковой углеводной специфичностью могут запускать разные сигнальные пути, ведущие к активации НАДФН-оксидазы, но не обязательно ассоциированные с участием богатых холестерином доменов. Экстракция части мембранного холестерина приводит к нарушению взаимодействия мембраны с цитоскелетом, что проявляется в увеличении спонтанной и лектин-индуцированной секреторной дегрануляции нейтрофилов и изменении их формы. Предполагается, что в холестерин-зависимых ответах клеток на лектины основную роль играет цитоскелет. 13

14