Цитокины семейства Фактора Некроза Опухолей С.А. Недоспасов Институт Молекулярной Биологии РАН им. Энгельгардта, Институт Физико-Химической Биологии им. Белозерского, МГУ Лекция 2

…Фактор некроза опухолей представляется мне «водородом» всех цитокинов на Земле....(Д.И. Менделеев, из письма Л. Олду)

Фактор некроза опухолей (ФНО, TNF ) Многофункциональный цитокин (мономер-17кД). Передает сигналы как клеточной смерти, так и активации экспрессии генов. Используется в некоторых протоколах противоопухолевой терапии. Связан с развитием септического шока. Играет важную роль в развитии иммунного ответа и воспаления, и в поддержании архитектуры вторичных лимфоидных органов Связан с развитием аутоиммунных заболеваний.

Bharat AggarwalGeorge KolliasDavid GoeddelBruce Beutler Доска Почета по отделу ФНО Lloyd Old

Благодарность за помощь в подготовке лекций Дмитрий Купраш Сергей Гривенников Ян Вилчек

Mitogenesis, collagenase, cytokines Inhibition of lipoprotein lipase, insulin resistance Altered function, Apoptosis Activation, apoptosis, IFN-, IL-2, other cytokines Activation, TNF, IL-1, IL-6, iNOS STIMULUS (Bacteria, Viruses,Cytokines) Bone resorption Acute phase proteins Fever, sleep Antibodies iNOS Cytokines, adhesion molecules, coagulation factors, Monocyte Endothelium B cell T cell Brain TNF Liver Adipocyte Fibroblast Myocyte Osteoclast Monocyte/Macrophage

Ligands and Receptors of the LT-TNF Subfamily LT 3 LT 2 LT 1 TNF 3 TNFRII TNFRI LT R LIGHT HVEM T-cells Immature DCs T-cells B-cells NK cells T-cells B-cells NK cells? Macrophages Neutrophils Dendritic cells NK cells Mast cells T-cells B cells Enterocytes Endothelial cells Most cell types Stromal cells Macrophages Mast cells Dendritic cells Immature DCs T-cells B cells NK cells Monocytes Endothelial cells

Fos Jun AP1 p50 p65 IkB IKK GENE ACTIVATION MEKK3 NF B SODD JNK DD FADD APOPTOSIS DD TNFR1 Pro-caspase-8 Pro-caspase-10 Effector caspases TNFR1 TRADD TNF c-FLIP DD RIP DED TRAF2 TAK1 MAP3K c-IAP1,2 MAPK phosphatase Cyt- c caspase 3 ROS

deleteriousbeneficial Lymphoid microarchitecture Host defense Systemic toxicity Autoimmunity «Плохой» и «хороший» TNF in vivo.

deleteriousbeneficial Lymphoid microarchitecture Host defense Systemic toxicity Autoimmunity «Плохой» и «хороший» ФНО in vivo. Как ФНО, продуцируемый индивидуальными типами клеток, вносит вклад в баланс между «плохим» и «хорошим»?

deleteriousbeneficial Lymphoid microarchitecture Host defense Systemic toxicity Autoimmunity deleterious beneficial Lymphoid microarchitecture Host defense Systemic toxicity Autoimmunity Баланс «полезных» и «вредных» свойств ФНО Что произойдет при системном блокировании ФНО у больных (препараты Infliximab, Etanercept)? - Инфекции (ТБ), лимфомы?

1.Генетический нокаут: изучение физиологических последствий инактивации одного единственного гена. 2. Проблема 1: из-за вырожденности функций близкородственных генов генетический нокаут может не «вскрыть» всех физиологических функций продукта гена. 3.Проблема 2: практически при любой технологии генетического нокаута нельзя полностью исключить нарушения регуляции соседних генов. 4.Проблема 3: точечная мутация может давать другой фенотип, чем нокаут. (Технология «нок-ин» позволяет воссоздать организм с выбранной точечной мутацией). Краткое введение в нокауты: «обратная» генетика

Стадии генетического нокаута

Технология генетического нокаута с использованием Cre/loxP или Flp/Frt систем (precision targeting) Adapted from Nature Reviews | Genetics

Мишень для генетических манипуляций: локус ФНО-ЛТ мыши LT TNF 1 kb Receptors: TNFR1Mouse chromosome 6 LT RMouse chromosome 6 TNFR2Mouse chromosome 4 Chromosome 17 MHC class IIIMHC class I

Панель мышей с кондиционной инактивацией гена ФНО Mice with floxed TNF gene loxP X Mice with TNF gene deletion in specific cell types X = T cells Deleter mice with restricted expression of Cre recombinase CD4-Cre = B cells X CD19-Cre Mx-Cre = MLys-Cre = Macrophages, neutrophils X loxP TNF Inducibly, in all cells

Эффективность и специфичность делеции гена ФНО в М-ФНО мышах TNF, pg/ml WT M-TNF TNF, pg/ml TNF KO WT M-TNF WT TNF KO TNF, ng/ml клетки брюшной полости нейтрофилысыворотка wtM-ФНО wt TNF mTNF wt M-ФНО GAPDH селезенка печень Костный мозг wt TNF тимус PEC M-ФНО ФНО КОО wt ФНО KO M-ФНО CD11b + Gr1 high wt TNF

Макрофаги и нейтрофилы являются главным источником «системного» ФНО Survival, % Hours 40 WT, T-TNF, B-TNF TNF KO, M-TNF M-TNF T-TNF B-TNF WT TNF KO TNF, ng/ml Уровень ФНО в сывороткеЛПС / D-Gal токсичность

TNF, ng/ml medium LPS HKLM CpG BLP WT MN-TNF KO TNF KO 4 ФНО является геном-мишенью при активации многих TLR рецепторов

Type of challenge/pathophysiological model Mice SEB/D-Gal LPS 100 g/20mg 0,4 mg0,7 mg1 mg1,5 mg WT, TNF floxed8/10 0/58/136/65/5 MN-TNF KO3/10 0/74/88/99/10 T-TNF KO1/10 -5/105/5 TNF KO0/10 0/72/116/128/10 ФНО, продуцируемый как макрофагами, так и Т лимфоцитами, является медиатором токсичности к продукту Грам-положительных бактерий, SEB

Pathology score ALT activity, U/ml T-TNF KO B-TNF KO TNF KO MN-TNF KO WT TNF KO MN-TNF KO T-TNF KO B-TNF KO AST activity, U/ml WT TNF KO MN-TNF KO T-TNF KO B-TNF KO Как T-ФНО, так и MН-TNF, являются медиаторами экспериментального аутоиммунного гепатита

ФНО, производимый как макрофагами, так и T клетками, необходим для защиты от инфекции внутриклеточными патогенами B-TNF KO M-TNF KO T-TNF KO TNF KO WT Выживаемость, % 2468 Дни M-TNF TNF KO WT B-TNF T-TNF Log CFU Листерия -модель внутриклеточного патогена Количество бактерий в печени

TNF KO WT CD11b iNOS bacilli TNF induces granuloma formation and antibacterial mechanisms 1)Granuloma- macrophages + CD4 T cells -activation of macrophages -expression of iNOS -chemokines/more cells 2) Granuloma formation requires TNF - anti-TNF or TNF KO- no granuloma - BCG expressing TNF- restoration of granuloma 3) TNF is produced by macrophages and by T cells 4) Blockade of TNF leads to TB reactivation

T cell TNF Macrophage SEB ? IFN ConA TNF amplification in response to polyclonal T-cell activation TNFR1

Кооперация ФНО, продуцируемого В и Т лимфоцитами, в развитии и поддержании структуры лимфатических узлов CR1 B220 CD3 wt B-TNFT,B-TNFT-TNF

Soluble TNF from B cells, but not from T cells (?) is critical for the maintenance of lymphoid organ structure

Days post i.p. inoculation 3 log LD50 Percentage survival B-TNF 9/11 TNF 2/7 wild type 5/5 Задержка терминальной фазы прионной болезни у B-TNF KO мышей

FDC precursor in spleen FDC precursor in lymph node FDC precursor in Peyers patch B cell TNF T cell TNF TNFR1 Target genes TNFR1 Target genes B cell TNF TNFR1 Target genes Роль ФНО, продуцирумого B и T лимфоцитами, в развитии фолликулярных дендритных клеток во вторичных лимфоидных органах

Superantigen induced shock Autoimmune hepatitis MN-TNF T-TNF deleterious beneficial TNF MN-TNF T-TNF deleterious beneficial TNF Intracellular pathogen beneficial deleterious MN-TNF T-TNF TNF LPS induced toxicity deleterious beneficial MN-TNF TNF Выводы: сложный баланс между защитными и разрушительными функциями ФНО in vivo. B-TNF deleterious beneficial B-TNF Lymphoid tissue maintenance, prion transmission

1.Рекомбинантный ФНО имеет ярко выраженный противоопухолевый эффект (некроз опухолей) на модельных опухолях мышей. 2.Опухоли, экспрессирующие ФНО, растут медленно или отторгаются. Может ли ФНО быть компонентом системы «иммунологического надзора» над возникающими опухолевыми клетками? 3.Инактивация ФНО защищает мышей от химически – индуцированных опухолей кожи. ФНО и рак

Является ли ФНО компонентом системы «иммунного надзора»? 0% 50% 100% Weeks Survival p53 KO p53-TNF KO Percent mice tumor free Weeks 129/Sv x p53 -/- IFN R -/- x p53 -/- IFN /p53 TNF/p53 30

Мыши, «гуманизированные» по локусу ФНО/ЛТ, - модель для изучения последствий блокировки ФНО Cosmid 031A LT TNF LT 10 kb LST1 (humTNF/LT) Tg (musTNF/LT) WT (musTNF/LT) human TNF/LT mouse TNF/LT Assessment of immune and host defense responses Pathological examination

TNF ng/mL Hu tg + ms +/- C57BL/6 60' 90' 120' Human TNFMouse TNF 60' 90' 120' ZW line TNF ng/mL Hu tg pos ms +/- (ZW) hTNF mTNF Hu tg pos ms +/+ (ZW) Hu tg pos ms +/+ (ZC) Hu tg pos ms -/- (ZC) Hu tg neg ms +/+ (ZC) Production of human and mouse TNF by different lines of Hu-TNF/LT Tg KO mice in vivo B (A and B). TNF levels in sera after ip injection of 100 mcg LPS. (C). Mice survival after ip injection of 10 g LPS+20mg D-GalN WT Hu tg+ ms+/+ (ZC) Triple TNF/LT KO Survival % Hours C A

Human TNF/LT transgene rectifies the response to a non-replicating TD antigen, SRBC, and renders transgenic mice completely protected against M. tuberculosis SRBC-specific IgG C57BL/6 OD 405 Hu tg pos ms WT/ Hu tg p s ms TNF/LT 3 KO Body weight C57Bl/6 Hu tg neg ms WT/ M/NE TNF KO Hu tg neg ms / Hu tg pos ms WT/ Hu tg pos ms / CFU/lung Lunga as % of body weight C57Bl/6 Hu tg neg ms WT/ M/NE TNF KO Hu tg neg ms / Hu tg pos ms WT/ Hu tg pos ms / Day 27

Inducible TNF blockade, both genetic and pharmacologic, protects mice from acute LPS/D-Gal toxicity i-TNF WT i-TNF + polyIC WT + polyIC WT+ Enbrel WT + remicade TNF KO Remicade – mouse antibody to human TNF (2 mg/mouse) Enbrel - soluble human TNFR2-Ig (1 mg/mouse) i-TNF+polyIC – inducible deletion of TNF gene using LoxP/Cre technology 0/5 survival, % 0/8 6/6 0/80/4 4/4 5/5 LPS / D-Gal toxicity 50 mcg LPS + 20 mg D- Gal/mouse 20 min later i.v. or i.p. injection of TNF blockers