Белорусский государственный университет Биологический факультет Кафедра биохимии Исследование антиоксидантных и прооксидантных свойств некоторых структурно близких флавоноидов Магистерская диссертация Долгодилиной Елены Викторовны Научный руководитель к.б.н., доцент Кукулянская Татьяна Александровна Минск 2009

Содержание Актуальность исследования Цель и задачи Материалы и методы Результаты Выводы V V V V V

Актуальность темы Свободные радикалы неминуемо образуются в клетке в процессе жизнедеятельности и, присутствуя в живых системах, вызывают повреждения макромолекул в клетке, что приводит к ряду негативных последствий. Как у растительных организмов, так и у животных имеются специальные антиоксидантные системы, функция которых и сводится к инактивации свободных радикалов. Условно такие системы можно разделить на две части: первая включает такие ферменты, как пероксидазу, каталазу, супероксиддисмутазу, а вторая - аскорбиновую кислоту, гидрохинон, кверцетин и другие низкомолекулярные соединения В ходе исследований показано, что наиболее токсичные радикальные продукты пероксидазного окисления удаляются, главным образом, отдельными биоантиоксидантами, к которым относятся и флавоноиды. Установлено также, что флавоноиды обладают выраженными антиаллергическими, антиканцерогенными, противовоспалительными и противовирусными свойствами

Цели и задачи Цель настоящей работы: изучение антиоксидантных и прооксидантных свойств структурно близких флавоноидов в процессах, сопровождающихся генерацией АФК, первичных и вторичных свободных радикалов. В соответствии с целью данной работы были поставлены следующие задачи: 1.изучить влияние таких флавоноидов, как кверцетина, эпикатехина и гесперетина, на ПОЛ, вызванное различными индукторами; 2.исследовать влияние выше указанных флавоноидов на процесс метаболической активации аминобифенилов по пероксидазному пути окисления; 3.изучить возможность данных флавоноидов выступать в качестве субстратов для пероксидазы;

Материалы и методы В работе использовались следующие вещества и ферменты: 3,3,5,5-тераметилбензидин, кверцетин, гесперетин, эпикатехин, лецитин соевый производства «Sigma», США НАДН производства «Renaul» Венгрия Твин 20 производства «Ferak», Германия ДНК фага производства «Сибэнзим», Россия o-дианизидин, пероксид водорода, диметилформамид, С 2 Н 5 ОН, хлороформ, FeSO 4, тиобарбитуровая кислота и другие реактивы квалификации марки «ЧДА» пероксидаза из хрена (КФ ) с Rz = 3 и СОД (КФ ) производства «Fluka», США Во время выполнения работы были использованы следующие методы анализа: спектральные (измерения проводили на спектрофотометрах Solar PV 150, UV-VIS Cary-50 в УФ и видимом диапазоне длин волн ) электрофоретические.

Основная часть Общая структура флавоноидов Флавоноиды – это фенольные соединения, широко распространённые в природе. Общая структура флавоноидов (С 6 С 3 С 6 ) представлена двумя ароматическимих кольцами, соединенными тремя углеродными атомами, наиболее часто с образованием гетероциклического кольца

Механизмы антиоксидантной активности флавоноидов могут быть следующие : 1.Подавление формирования активных форм кислорода путем ингибирования ферментов или хелатирование микроэлементов, учавствующих в образовании свободных радикалов. 2.Удаление активных форм кислорода. Благодаря более низким окислительно-восстановительным потенциалам, флавоноиды (Fl- ОН) способны восстанавливать высоко окисленные свободные радикалы 3.Сверхрегулирование или защита протекторов антиоксидантов

Накопление продуктов ПОЛ в присутствии кверцетина, гесперетина и эпикатехина На рисунке слева представлено накопление продуктов ПОЛ, индуцированное СФ, в присутствии кверцетина, гесперетина и эпикатехина (1.- спонтанное ПОЛ, 2.- ПОЛ, индуцированное СФ ( М Fe 2+ / М Н 2 О 2 ) в отсутствии флавоноидов; для флавоноидов : М, М, М, М, М, М, М) На рисунке справа представлено накопление продуктов ПОЛ, индуцированное Fe 2+, в присутствии кверцетина, гесперетина и эпикатехина (1.- спонтанное ПОЛ, 2.- ПОЛ, индуцированное Fe 2+ в концентрации М в отсутствие флавоноидов;для флавоноидов : М, М, М, М, М, М, М) Примечание II: * - различия достоверны при р 0,05

Пероксидазное окисление 3, 3,5,5 -тераметилбензидина (ТМБД) Подробный механизм окисления ТМБД Пероксидазное окисление ТМБД в 0,1 М цитратно - ацетатном буфере рН 5,5 (конечный объём реакционной смеси составлял 2,5 мл и содержал [Н 2 О 2 ]=0,4 ммоль/л, [ПХ]= М): 1-[TМБД] = 1 ммоль/л, 2-[ТМБД] = 0,8 ммоль/л, 3-[ТМБД] = 0,6 ммоль/л, 4-[ТМБД] = 0, 4 ммоль/л, 5-[ТМБД] = 0, 2 ммоль/л, 6-[ТМБД] = 0,1 ммоль/л.

Влияние флавоноидов на процесс пероксидазного окисления 3,3,5,5-тераметилбензидина Пероксидазное окисление ТМБД в 0,1 М цитратно - ацетатном буфере рН 5,5 (конечный объём реакционной смеси составлял 2,5 мл и содержал [Н 2 О 2 ]=0,4 мМ/л, [ПХ]= М, [ТМБД]= 0,6 мМ/л) в присутствии кверцетина: 1 - [кверцетин] =0 мкМ/л, 2 - [кверцетин] =0,01 мкМ/л, 3 - [кверцетин] =0,04мкМ/л, 4 - [кверцетин] =0,08 мкМ/л, 5 - [кверцетин] =0,12 мкМ/л, 6 - [ кверцетин] =0,2 мкМ/л, 7 - [кверцетин] =0,6 мкМ/л, 8 - [кверцетин] =1 мкМ/л, 9 - [ кверцетин] =4 мкМ/л. Пероксидазное окисление ТМБД в 0,1 М цитратно - ацетатном буфере рН 5,5 (конечный объём реакционной смеси составлял 2,5 мл и содержал [Н 2 О 2 ]=0,4 мМ/л, [ПХ]= М, [ТМБД]= 0,6 мМ/л) в присутствии эпикатехина: 1 - [эпикатехин] =0 мкМ/л, 2 - [эпикатехин] =0,01 мкМ/л, 3 - [эпикатехин] =0,04 мкМ/л, 4 - [эпикатехин] =0,08 мкМ/л, 5 - [эпикатехин] =0,12 мкМ/л, 6 - [ эпикатехин] =0,2 мкМ/л, 7 - [эпикатехин] = 0,6 мкМ/л, 8 - [эпикатехин] = 1 мкМ/л, 9 - [ эпикатехин] = 4 мкМ/л.

Химические формулы кверцетина, гесперетина и эпикатехина

Пероксидазное окисление кверцетина Окисление протекало в 0,1 М цитратно – ацетатном буфере (рН 5,5), [ПХ]= М, [Н 2 О 2 ]=50 мкмоль/л: 1 - [кверцетин] = 75 мкмоль/л, 2 - [кверцетин] = 65 мкмоль/л, 3 - [кверцетин] =55 мкмоль/л, 4 - [кверцетин] =45 мкмоль/л, 5 - [кверцетин] =35 мкмоль/л, 6 - [кверцетин] = 25 мкмоль/л, 7 - [кверцетин] = 20 мкмоль/л, 8 - [кверцетин] = 10 мкмоль/л, 9 - [кверцетин] = 5 мкмоль/л.

Пероксидазное окисление эпикатехина Окисление протекало в 0,1 М цитратно – ацетатном буфере (рН 5,5), [Н 2 О 2 ]=50 мкмоль/л : На рисунке слева: [ПХ]= М, 1 - [эпикатехин] = 105 мкмоль/л, 2 - [эпикатехин] = 95 мкмоль/л, 3 - [эпикатехин] =85 мкмоль/л, 4 - [эпикатехин] =75 мкмоль/л, 5 - [эпикатехин] =55 мкмоль/л, 6 - [эпикатехин] = 25 мкмоль/л, 7 - [эпикатехин] = 20 мкмоль/л, 8 - [эпикатехин] = 5 мкмоль/л. На рисунке справа: [ПХ]= М, 1 - [эпикатехин] = 105 мкмоль/л, 2 - [эпикатехин] = 95 мкмоль/л, 3 - [эпикатехин] =75 мкмоль/л, 4 - [эпикатехин] =65 мкмоль/л, 5 - [эпикатехин] =55 мкмоль/л, 6 - [эпикатехин] = 45 мкмоль/л, 7 - [эпикатехин] = 35 мкмоль/л, 8 - [эпикатехин] = 25 мкмоль/л, 9 - [эпикатехин] = 20 мкмоль/л, 10 - [эпикатехин] =10 мкмоль/л, 11 - [эпикатехин] =5 мкмоль/л

Электрофореграмма ДНК фага, инкубированной в системе пероксидазного окисления о-дианизидина Электрофореграмма ДНК фага, инкубированной в системе пероксидазного окисления о-дианизидина ([ДНК] =0,4мкг, [Н 2 О 2 ] = 1 ммоль/л, [ПХ] = моль/л): 1. ДНК, 2. ДНК, ПХ, Н 2 О 2, 3. ДНК, ПХ, о-дианизидин моль/л, 4. ДНК, ПХ, Н 2 О 2, о-дианизидин моль/л, 5. ДНК, ПХ, Н 2 О 2, о-дианизидин 2, моль/л, 6. ДНК, ПХ, Н 2 О 2, о-дианизидин моль/л, 7. ДНК, ПХ, Н 2 О 2, о-дианизидин моль/л,8. ДНК, ПХ, Н 2 О 2, о-дианизидин 2, моль/л, 9. ДНК, ПХ, Н 2 О 2, о- дианизидин моль/л, 10. ДНК, ПХ, Н 2 О 2, о-дианизидин моль/л, 11. ДНК, ПХ, Н 2 О 2, о-дианизидин 2, моль/л, 12. ДНК, ПХ, Н 2 О 2, о-дианизидин моль/л.

Влияние кверцетина на повреждение ДНК продуктами пероксидазного окисления о-дианизидина Электрофореграмма ДНК фага, инкубированной в системе пероксидазного окисления о-дианизидина ( [о-дианизидин]= моль/л, [ДНК] =0,4мкг, [Н 2 О 2 ] = 1 ммоль/л, [ПХ] = моль/л) с различными концентрациями кверцетина : 1. ДНК, 2. ДНК, ПХ, Н 2 О 2, 3. ДНК, ПХ, о-дианизидин, 4. ДНК, ПХ, Н 2 О 2, о- дианизидин, 5. ДНК, ПХ, Н 2 О 2, о-дианизидин, кверцетин моль/л, 6. ДНК, ПХ, Н 2 О 2, о-дианизидин, кверцетин моль/л, 7. ДНК, ПХ, Н 2 О 2, о- дианизидин, кверцетин моль/л, 8. ДНК, ПХ, Н 2 О 2, о-дианизидин, кверцетин моль/л, 9. ДНК, ПХ, Н 2 О 2, о-дианизидин, кверцетин моль/л, 10. ДНК, ПХ, Н 2 О 2, о-дианизидин, кверцетин моль/л, 11. ДНК, ПХ, Н 2 О 2, о- дианизидин, кверцетин моль/л, 12. ДНК, ПХ, Н 2 О 2, о-дианизидин, кверцетин моль/л.

Влияние эпикатехина на повреждение ДНК продуктами пероксидазного окисления о-дианизидина Электрофореграмма ДНК фага, инкубированной в системе пероксидазного окисления о-дианизидина ( [о-дианизидин]= моль/л, [ДНК] =0,4мкг, [Н 2 О 2 ] = 1 ммоль/л, [ПХ] = моль/л) с различными концентрациями эпикатехина: 1. ДНК, 2. ДНК, ПХ, Н 2 О 2, 3. ДНК, ПХ, о-дианизидин, 4. ДНК, ПХ, Н 2 О 2, о- дианизидин, 5. ДНК, ПХ, Н 2 О 2, о-дианизидин, эпикатехин моль/л, 6. ДНК, ПХ, Н 2 О 2, о-дианизидин, эпикатехин моль/л, 7. ДНК, ПХ, Н 2 О 2, о- дианизидин, эпикатехин моль/л, 8. ДНК, ПХ, Н 2 О 2, о-дианизидин, эпикатехин моль/л, 9. ДНК, ПХ, Н 2 О 2, о-дианизидин, эпикатехин моль/л, 10. ДНК, ПХ, Н 2 О 2, о-дианизидин, эпикатехин моль/л, 11. ДНК, ПХ, Н 2 О 2, о-дианизидин, эпикатехин моль/л, 12. ДНК, ПХ, Н 2 О 2, о-дианизидин, эпикатехин моль/л.

Влияние гесперетина на повреждение ДНК продуктами пероксидазного окисления о-дианизидина Электрофореграмма ДНК фага, инкубированной в системе пероксидазного окисления о-дианизидина ([о-дианизидин]= моль/л, [ДНК] =0,4мкг, [Н 2 О 2 ] = 1 ммоль/л, [ПХ] = моль/л) с различными концентрациями гесперетина : 1. ДНК, 2. ДНК, ПХ, Н 2 О 2, 3. ДНК, ПХ, о-дианизидин, 4. ДНК, ПХ, Н 2 О 2, о- дианизидин, 5. ДНК, ПХ, Н 2 О 2, о-дианизидин, гесперетин моль/л, 6. ДНК, ПХ, Н 2 О 2, о-дианизидин, гесперетин моль/л, 7. ДНК, ПХ, Н 2 О 2, о- дианизидин, гесперетин моль/л, 8. ДНК, ПХ, Н 2 О 2, о-дианизидин, гесперетин моль/л, 9. ДНК, ПХ, Н 2 О 2, о-дианизидин, гесперетин моль/л, 10. ДНК, ПХ, Н 2 О 2, о-дианизидин, гесперетин моль/л, 11. ДНК, ПХ, Н 2 О 2, о-дианизидин, гесперетин моль/л, 12. ДНК, ПХ, Н 2 О 2, о-дианизидин, гесперетин моль/л.

Выводы 1.Было показано, что в процессе перекисного окисления лецитина, индуцированного системой Фентона ([Fe 2+ ]= моль/л, ([Н 2 О 2 ]= моль/л), кверцетин, эпикатехин и гесперетин проявляют прооксидантные свойства. Наибольшая прооксидантная активность проявляется кверцетином в концентрации моль/л, гесперетином моль/л, эпикатехином моль/л. 2.Установлено, что если в качестве индуктора перекисного окисления липидов выступает Fe 2+ ( моль/л), то кверцетин проявляет антиоксидантные свойства и максимальная антиоксидантная активность наблюдается в концентрации моль/л. Эпикатехин и гесперетин в указанных условиях проявляют как антиоксидантные, так и прооксидантные свойства. Гесперетин проявляет антиоксидантную активность в концентрациях моль/л, а прооксидантную и моль/л. Эпикатехин выступает антиоксидантом в концентрациях с по моль/л, а при концентрации моль/л наблюдается прооксидантный эффект.

3.Показано, что кверцетин и эпикатехин в концентрациях 1 мкмоль/л и 4 мкмоль/л проявляют антиоксидантные свойства в отношении процесса пероксидазного окисления 3,3,5,5- тераметилбензидина, при этом кверцетин гораздо эффективнее подавляет окисление данного аминобифенила. Наиболее вероятно, что при совместном окислении тетраметилбензидина и флавоноидов (кверцетина, эпикатехина) происходит активация окисления медленно окисляемого субстрата (флавоноида) и частичное или полное ингибирование превращения быстро окисляемого субстрата (аминобифенила) 4.Было установлено, что кверцетин и эпикатехин, проявляя антиоксидантные свойства, способны подвергаться окислению в системе пероксидаза/ Н 2 О 2. В случае кверцетина наиболее вероятным механизмом является одноэлектронное окисление флавоноида: пх/ Н 2 О 2 Fl Fl ( одноэлектронное окисление) Fl +НАДН Fl + НАД НАД + О 2 НАД+ + О 2 –

5.Установлено, что все три флавоноида – кверцетин, эпикатехин и гесперетин - проявляют антиоксидантные свойства и ингибируют повреждение ДНК радикалами, образующимися в ходе пероксидазного окисления о-дианизидина. Наиболее эффективными ингибиторами являются кверцетин, эпикатехин (в концентрации моль/л), менее эффективен гесперетин ( моль/л).

Спасибо за внимание!!! Exit