Трепонемы, лептоспиры. Трепонемы, лептоспиры. Микробиологическая диагностика сифилиса и лептоспирозов Микробиологическая диагностика сифилиса и лептоспирозов Темникова Наталья Владимировна доцент кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии «Сифилис – это драма в которой действия чередуются с антрактами» А.Фурнье ( )

Спирохеты Спирохеты – тонкие, спиртальные («спирта» –спирталь, «хета» – волос) подвижные, грам- бактерии длиной от нескольких до сотен мкм. Выделяют три типа движений – вращение вокруг оси, сгибательные, поступательно-вращательные (штопор о- образные). Таксономия представлена тремя родами Treponema, Borrelia, Leptospira). Таксономия представлена тремя родами ( Treponema, Borrelia, Leptospira). окрашиваются по Романовскому-Гимзе. в отличие от других подвижных бактерий не имеют наружных жгутиков. Аппарат движения Аппарат движения – фибриллы находятся между наружной оболочкой и протоплазматическим цилиндром в виде аксиальной нити, закрученной вокруг цилиндра и придающей спирохете спиртальную форму. 2

Извитые формы микроорганизмов

Электронно-микроскопическая схема трепонемы. Сократительные фибриллы обеспечивают двигательную активность. Сократительные фибриллы обеспечивают двигательную активность. Прижизненная микроскопия проводится в темном поле (нативный препарат) Прижизненная микроскопия проводится в темном поле (нативный препарат) микроскопическая схема трепонемы

Род Treponema Трепонема – «сгибающаяся нить». Туго закрученные спирталевидные бактерии с одинаковыми по высоте завитками (около 10). T. pallidum окрашиваются плохо в отличии от других трепонем. Бледно-розовые при окраске по Романовскому-Гимзе (Р-Г) Выявляют серебрением, темнопольной микроскопием, МФА. 8-14, среднекрупных завитков плавное, вращательное, плавное, сгибательное, вращательное, поступательное

История открытия сифилиса Филип Рикор доказал, что сифилис и гонорея это разные заболевания.1837 г. Мечников и Ру заразили шимпанзе сифилисом 1905 г. Ф.Шаудин и Е. Гоффман открыли Бледную Трепонему 1906 г. (темнопольная микроскопия). Совместно с И. Мечниковым. В 1906 году немецкий иммунолог и микробиолог Август фон Вассерман совместно с Альбертом Нейссером создал методику, получившую название «реакция Вассермана». Этот метод диагностики актуален до сих пор. А т.ж. Их ассистенты Шухт и Брук. Эрлих - синтезировал сальварсан 1914 г. Арнольд и Харрис впервые применили пенициллин для лечения сифилиса 1949 г. 6

Таксономия Возбудитель сифилиса относится к порядку Spirochaetales, семейству Spirochaetaeceae, роду Treponema, виду Treponema pallidum, подвиду pallidum. 7

РАЗЛИЧАЮТ ФОРМЫ БЛЕДНОЙ ТРЕПОНЕМЫ: спирталевидная или штопорообразная цист форма - является формой выживания бледной трепонемы в неблагоприятных условиях среды и рассматривается как стадия покоя T. рallidum; обладает антигенной активностью. L –форма является способом выживания бледной трепонемы, обладает слабой антигенной активностью. полимембранофагосомная Устойчивость бледной трепонемы к условиям внешней среды: быстро погибает при высыхании и прямом действии УФО во внешней среде сохраняется 12 часов (полотенце, мочалка) При t 40º сохраняется 1 час При t 60º - 15 минут При t 100º - погибает погибает в 0,5% растворе карболовой кислоты 8

Эпидемиология Пути передачи: половой (наиболее частый и типичный путь инфицирования; заражение происходит через поврежденную кожу либо слизистые оболочки); трансплацентарный (передача инфекции от больной матери плоду через плаценту, ведущее к развитию врожденного сифилиса); трансфузионный (при переливании крови от донора, больного сифилисом в любой стадии); – контактно-бытовой (является редкостью; встречается преимущественно при бытовом контакте с детьми родителей, имеющих высыпания на коже/ слизистых оболочках); – профессиональный (заражение персонала лабораторий, работающего с зараженными экспериментальными животными, а также акушеров- гинекологов, хирургов, стоматологов, патологоанатомов, 9

Первичный сифилис (6-8 недель скрытый ранний от 8 до 12 недель В месте внедрения бледных трепонем развивается первичный аффект эрозия или язва диаметром от 2– 3 мм (шанкр) до 1,5–2 см и более (гигантский шанкр), округлых очертаний, с ровными краями, гладким, блестящим дном, блюдцеобразной формы (язва), со скудным серозным отделяемым, безболезненная при пальпации; Первичный аффект сопровождается регионарным лимфаденитом, реже лимфангитом; Если не проводилось лечения – клиника затухает и через несколько недель, месяцев – вторичный сифилис. 10

Вторичный сифилис Обусловлен гематогенной диссеминацией инфекции на фоне развития инфекционного иммунитета и проявляется: высыпаниями на коже розеолезными (пятнистыми), папулезными (узелковыми), папуло-пустулезными (гнойничковыми); лейкодермой, алопецией; поражения внутренних органов, опорно-двигательного аппарата и нервной системы. Третичный сифилис Может развиваться непосредственно за вторичным сифилисом, но в большинстве случаев между вторичным и третичным периодами наблюдается скрытый период. Появление симптомов третичного сифилиса возможно спустя многие годы после заражения при бессимптомном течении инфекции. Проявляется высыпаниями на коже/слизистых оболочках, поражениями внутренних органов, опорно-двигательного аппарата и нервной системы. 11

12

13

Микроскопическое исследование Это один из методов микробиологической диагностики возбудителей инфекционных заболеваний, который проводится с целью определения морфологических и тинкториальных свойств микроорганизмов в нативных или окрашенных препаратах. Это один из методов микробиологической диагностики возбудителей инфекционных заболеваний, который проводится с целью определения морфологических и тинкториальных свойств микроорганизмов в нативных или окрашенных препаратах. Наиболее часто применяются: светлопольная микроскопия, микроскопия в темном поле, фазово-контрастная и люминесцентная микроскопия. Для специальных микробиологических исследований используется электронная микроскопия Наиболее часто применяются: светлопольная микроскопия, микроскопия в темном поле, фазово-контрастная и люминесцентная микроскопия. Для специальных микробиологических исследований используется электронная микроскопия

Культуральные и биохимические свойства Трепонемы очень прихотливы к условиям культивирования и на обычных средах не растут. Под действием пенициллина переходит в L – формы. Вирулентные штаммы не растут даже на средах сложного состава. Культивируют в тестикулярных пассажах на кроликах. Биохимические характеристики для дифференциации трепонем практически не используются. Антигенная структура. Антигенная структура. Имеют перекрестные флагеллиновые антигены с др. спирохетами (боррелиями, лептоспиртами), специфический трепонемный (белковый) Аг, фосфолипидный (кардиолипиновый) Аг Вассермана (аналогичен мембранному митохондриальному Аг, получаемому из бычьего сердца). 15

Для лабораторной диагностики сифилиса применяются прямые и непрямые методы. Прямые методы диагностики выявляют самого возбудителя или его генетический материал. Абсолютным доказательством наличия заболевания является обнаружение бледной трепонемы в образцах, полученных из очагов поражений, с помощью микроскопии в темном поле зрения или прямой иммунофлуоресценции(РИФ), а также выявление специфической ДНК и РНК возбудителя методом полимеразной цепной реакции с использованием тест- систем, разрешенных к медицинскому применению в РФ. 16

Лабораторная диагностика Бактериоскопическое исследование Бактериоскопическое исследование эффективно при первичном сифилисе. Исследуют материал из первичной сифиломы, пунктата лимфатических узлов. Из них готовят мазки и окрашивают по Романовскому-Гимза. Эффективна темнопольная и люминесцентная микроскопия (РИФ). 17

Темнопольная микроскопия Схема микроскопа для наблюдения в темном поле Препараты для темнопольной микроскопии готовят по типу раздавленной капли. Исследуемый материал (бактериальная культура в физиологическом растворе) наносят на предметное стекло, которое покрывают покровным. Капля материала заполняет все пространство между покровным и предметным стеклом, образуя ровный слой. Темнопольная микроскопия используется для изучения живых неокрашенных микроорганизмов.

РИФ (реакция иммунофлуоресценции) – достаточно чувствительна на всех стадиях сифилиса (чувствительность при первичном сифилисе – %, при вторичном и позднем – %), специфичность – %. РИФ применяется для дифференциации скрытых форм сифилиса и ложноположительных результатов исследований на сифилис. 19

Непрямые методы диагностики сифилиса – это выявление антител к возбудителю сифилиса в сыворотке крови и СМЖ Нетрепонемные тесты: – реакция микропреципитации (микрореакция) с плазмой и инактивированной сывороткой или ее аналоги Характеристика нетрепонемных тестов: – применяется антиген нетрепонемного происхождения (кардиолипиновый антиген); – позитивируются через 1-2-недели после образования первичной сифиломы; – имеют невысокую чувствительность (до 70–90% при ранних формах и до 30% - при поздних) Преимущества нетрепонемных тестов: – низкая стоимость; – техническая простота выполнения и быстрота. Показания к применению нетрепонемных тестов: – проведение скрининга населения на сифилис; – определение активности инфекции и эффективности лечения. 20

Непрямые методы диагностики сифилиса Нетрепонемные тесты РСК РСК (реакция Вассермана). Нетрепонемные антигены (Кардиолипин бычьего сердца) сходен с антигеном возбудителя сифилиса. Кардиолипин в некотором количестве содержится и в клетках человеческого организма. реакция Вассермана может быть положительной после перенесенных тяжелых вирусных и прочих заболеваний пневмонии, малярии, болезней печени и крови, при беременности. Позитивность реакции Вассермана принято обозначать количеством крестов: ++++ (резко положительная реакция) свидетельствует о полной задержке гемолиза; +++ (положительная реакция) соответствует значительной задержке гемолиза, ++ (слабоположительная реакция) свидетельство частичной задержки гемолиза, + (сомнительная реакция) соответствует о незначительной вдержке гемолиза. Отрицательная RW характеризуется полным гемолизом во всех пробирках опыта. При серодиагностике необходимо учитывать серонегативность первичного сифилиса в первые недели заболевания. 21

Непрямые методы диагностики сифилиса Трепонемные тесты: ИФА (иммуноферментный анализ) - высокочувствительный и специфичный тест. Дает возможность дифференцированного и суммарного определения IgM и IgG антител к возбудителю сифилиса; иммуноблоттинг является модификацией ИФА. РИБТ (РИТ) (реакция иммобилизации бледных трепонем) – классический тест для выявления специфических трепонемных антител. Применяют для дифференциальной диагностики скрытых форм сифилиса с ложноположительными результатами серологических реакций. Трепонемные тесты не могут быть использованы для контроля эффективности терапии, т.к. антитрепонемные антитела длительно циркулируют в организме больного, перенесшего сифилитическую инфекцию; 22

Общая характеристика трепонемных тестов – применяется антиген трепонемного происхождения – чувствительность – %; – специфичность – %. Становятся положительными с 3-й недели от момента заражения и ранее. Показания к применению трепонемных тестов: – подтверждение положительных результатов нетрепонемных тестов – проведение методами ИФА скрининга отдельных категорий населения на сифилис (доноры, беременные, больные офтальмологических, психоневрологических, кардиологических стационаров, ВИЧ-инфицированные). 23

Лечение. Лечение. Чаще используют депонированные пенициллины с пролонгированным действием, при непереносимости – макролиды, тетрациклины, цефалоспорины. Штаммы бледной трепонемы обычно чувствительны к применяемым антибиотикам. Профилактика. Профилактика. Специфической профилактики (эффективных вакцин) не разработано. Основное значение – пропаганда здорового образа жизни, безопасный секс, своевременное выявление и лечение больных, серологическое обследование доноров, беременных, больных в ЛПУ, групп риска (наркоманы, проститутки, гомосексуалисты и др.). 24