Л.Н.Гумилев атындағы Еуразия Ұлттық Университеті Жаратылыстану ғылымдары факультеті Тобы: Бг-41 Орындаған: Умирзакова А.О.

Спектроскопия әдістері бойынша атом, молекула энергия деңгейлерін және олардан құралған макроскопиялық жүйелерді, энергия деңгейлерінің арасындағы кванттық ауысуларды анықтайды. Спектроскопияның негізгі қолданылатын маңызды салалары – спектрлік талдау және астрофизика.

Жарықты сіңіргенде зерттелетін заттардың атомдары мен молекулалары қоздырылған жаңа күйге ауысады. Сәулені сіңіретін заттың түріне және сіңірілген энергияның өзгеруіне байланысты биохимияда кеңінен қолданатын фотометрикалық анализдерді былай жіктеуге болады: 1. Атомно-абсорбциялық анализ – зерттелетін заттың атомдарының жарық сәулесінің энергиясын сіңіруіне негізделген. 2. Молекулярно-абсорбциялық анализ - зерттелетін заттың молекулаларының спектрдің ультракүлгін, көрінетін және инфрақызыл аймақтарында жарықты сіңіруіне (спектрофотометрия, фотоколориметрия және инфрақызыл- спектроскопия) негізделген. 3. Флуорометрлік анализ – зерттелетін заттың қоздырылған молекулаларының энергия бөлуінің нәтижесінде пайда болатын сәулені өлшеуге негізделген.

Фотоколориметрия және спектрофотометрияны фотометрлі анализ әдістеріне жатқызады. Фотометрлі әдістерде зерттелетін заттың жарықты таңдап сіңіруін пайдаланады. Жұтылатын кванттың энергиясы соңғы Е2- және бастапқы Е1-квант энергияларының деңгейлерінің арасындағы айырмашылығына сәйкес болған кезде ғана молекулалар жарықты сіңіреді: hv = ΔЕ = Е2 – E1. Бұл жерде h – Планк тұрақтысы, v – сіңірілетін сәуленің жиілігі, ол сіңірілген кванттың энергиясымен анықталады және сәуленің таралу жылдамдығының (с) толқын ұзындығына (λ) қатынасымен көрсетіледі (v = с/λ).

Жұту спектрінің максимумы - зерттелетін молекуланың маңызды оптикалық сипаттамасы болып табылады. Молекуланың құрамындағы оның жұту спектріне үлес қосатын химиялық топты хромофор деп атайды. Олар - барлық амин қышқылдарының молекуласында болатын карбонил (>C=O) тобы және полипептидтердегі пептидтік байланысқа қатысатын топтар. Триптофан және одан төмендеу деңгейде – тирозин мен фенилаланин белоктың басты хромофорлары болып табылады.

Ароматикалы амин қышқылдарының ультракүлгін жарықты сіңіруі

Нуклеин қышқылдарындағы негізгі хромофорлар - пуринді және пиримидинді азоттық негіздер. Молекула ішінде түйіндес байланыстар құралғанда электрондардың қоздырылған күйінің энергиясы төмендейді және оның салдарынан хромофор жоғары толқын ұзындығындағы жарықты жұта бастайды. Жұту спектріндегі осындай ығысуды – батохромды деп аталады. Керісінше, спектрдің қысқатолқынды аймаққа ығысуы – гипсохромды болып табылады. Гиперхромды және гипсохромды эффекттер – жұтылудың (экстинкцияның) жоғарылауына және төмендеуіне сәйкес келеді.

Қолданатын аспапқа байланысты фотометрлік анализді спектрофотометрлік және фотоколориметрлік әдістер деп екіге бөледі. Спектрофотометрлік әдіс - монохроматты жарықты сіңіруге негізделген анализ болса; Фотоколориметрлік әдіс – спектрдің көрінетін аймағындағы полихроматты (яғни, монохроматты емес) жарықты сіңіруге негізделген. Екі әдістің де негізі - жарықты сіңіру деңгейіне және жарықты сіңіретін заттың концентрациясының арасындағы пропорционал тәуелділіктің болуында. Фотометрикалық әдістер тікелей және жанамалы деп екіге бөлінеді. o Тікелей әдістерді қолданғанда анықталатын молекуланы реагенттің көмегімен жарықты жұта алатын қосылысқа айналдырады. Сосын осы қосылыстың ерітіндісінің жарықты жұту деңгейін өлшейді. o Жанамалы әдістің анализдеріне көмекші қосылыстарды пайдаланады. Ондай қосылыстар анықталатын затпен әрекеттескенде өздері ыдырап кетеді, немесе жарықты сіңіретін жаңа қосылыстарға айналады.

Ультракүлгін және көрінетін жарық сіңіру спектрофотометриясы Жарық толқындары (нм) X-ray UV VIS IR Микротолқын Электронды Тербелмелі Айналмалы Ядролы Ішкі қабық Сыртқы қабық Зерттеу әдістері: Стандартты Инфрақызыл Ядролық сіңіретін және Раман магнитті спектроскопия спектроскопия резонанс

Е және Н компоненттерді көрсететін электромагнитті толқын

Энергия деңгейі Молекуладағы атомдардың арақашықтығы Фотонды жұтқанда молекуланың энергиясының өзгеруі Төменгі қисық молекуланың негізгі, тыныш күйдегі энергия деңгейін (G), жоғарғы қисық қоздырылған күйдегі энергия деңгейін (S 1 ) көрсетеді. Жебеше (стрелка) электрондардың бір деңгейден екінші деңгейге көтерілуін бейнелейді. Фотоннның энергиясы электронды Е 1 энергия деңгейінен Е 2 деңгейге көтеруге қажет энергиямен тең келгенде, суретте вертикал жебемен көрсетілген молекуладағы G-дан S 1 -ға электрондардың өтуі мүмкін болады:

Абсорбция спектрі молекуланың табиғатын анықтауға көмектесе алады, себебі – жұтудың (абсорбцияның) толқын ұзындықтары зерттелетін молекуладағы функционалды топтарға немесе атомдарының орналасу тәртібіне тәуелді. Төменде көрсетілген оксигемоглобиннің абсорбция спектрі оның құрамында темір- порфирин бөлігінің болуына тікелей байланысты. Абсорбция Толқын ұзындығы Гемоглобиннің көрінетін абсорбциялық спектрі

Қазіргі спектрофотометрлер жоғары монохроматталған сәуленің ағынымен жұмыс істеуге мүмкіндік береді. Олар зерттелетін заттардың концентрациясын және жұту спектрлерін анықтау үшін қолданылады. Спектрофотометр мынадай структуралық компоненттерден тұрады: жарық көзі, монохроматор, кювет бөлімі, фотоэлемент және тіркейтін құрал. Жарық көзінен шыққан жарық шоғы ену саңылауы арқылы монохроматорға жетеді және дифракция торы немесе призма арқылы спектрге ыдырайды. Шығу саңлауынан келген монохроматталған сәуле ағынының жолына контрольды және зерттелетін ерітінді құйылған кюветтерді кезекпен қояды. Кюветтен өткен сәуле жарық энергиясын электр энергиясына айналдыратын фотоэлементке жетеді. Сосын электр сигналы күшейіп, тіркеледі. Абсорбцияны тәжірибе жүзінде спектрофотометр аспабымен өлшейді. Бұл аспап алдын-ала таңдап алынған толқын ұзындығында жарық бөледі. Жарық зерттелетін биоматериалға бағытталады. Сосын биоматериалдан өткен жарықтың күшін (интенсивтігін) өлшейді. Спектрофотометрде өлшеу алдында биоматериалды еріткіште ерітіп, кюветке құяды.

Монохроматор Фототүтік Жарық Саңлаулар Оптика Үлгі Жазғыш көзі жүйесі камерасы немесе принтер Стандартты, бір сәулелі спектрофотометрдің схемасы Спектрофотометрде монохроматты жарықты (арнайы толқын ұзындығы бар жарықты) таңдап алу үшін оптикалық жүйе болу керек. Ол үшін қазіргі күнгі спектрофтометрлерде призманы, немесе қажетті толқын ұзындығын беретін диффракциялық торды жиірек қолданады.

Монохроматор дегеніміз – жарық көзінен бөлініп шыққан жарықтың барлық спектрлерінің ішінен белгілі толқын ұзындығы бар сәулені іріктейтін оптикалық жүйе. Фотоэлементтер жарық энергиясын электр энергиясына айналдырады. Фотокөбейіткіш. Оның сезімталдығы қарапайым фотоэлементпен салыстырғанда жоғарылау. Саңылаудың кеңдігі. Зерттелетін ерітіндіге түсетін жарықтың толқын ұзындықтарының диапазоны саңылаудың кеңдігіне тәуелді болады. Фотоэлектроколориметр дегеніміз – жарық фильтрлерінің көмегімен cәуле ағынын монохроматтайтын оптикалық аспап. Зерттелетін ерітіндінің камерасы. Өңделген монохроматты жарық зерттелетін ерітінді қойылған камераға бағытталады Кюветтер. Зерттелетін затты оған сәйкес келетін еріткіште ерітеді, сосын оптикалы мөлдір ыдысшаға – кюветке құяды.

Биомолекуланың UV-VIS спектрлері молекуланың структурасы туралы көп мәлімет бере алады. Сондықтан, белгісіз биомолекуланы зерттеулерде спектрлік анализдер алғашқы және негізгі өлшеулер болып табылады. Көпшілік жағдайда табиғи молекулалардың құрамында өздеріне тән спектрі бар хромофорлы (белгілі толқын ұзындығын жұтатын) функционалды топтар болады. Келесі бетте суретте жақсы зерттелген хромофор бола алатын биомолекулалар – флавинаденинмононуклеотидтің (ФМН) және никотинамидадениндинуклеотидтің (НАД + ) спектрлері көрсетілген.

Ферменттік реакцияларда электрон-тасығыштардың қызметін атқаратын FMN мен NAD тотыққанда немесе тотықсызданғанда олардың спектрлерінде ерекше пиктер пайда болады.

Молекулалардың арасындағы өзара әрекеттесулерді тіркей алатын эффектілі және ыңғайлы әдіс – дифференциалды спектроскопия. Кіші молекулалардың макромолекулалармен әрекеттесулерін тасушы белок – гемоглобиннің мысалынан көруге болады. Инозитолгексафосфат секілді кіші молекула немесе басқа лиганд түрі гемоглобинмен байланысқанда ол белоктың спектріндегі өзгерістерді байқауға болады. Содан кейін бастапқы және соңғы спектрлерді (еріткіштегі белокты және сол еріткіштегі белок-лиганд қоспасының спектрлерін) салыстырып, арасындағы айырмашылық екі-сәулелі спектрофотометрде тіркеледі. Тек спектрлік сызбабейне ғана қажет болатындықтан дифференциалды спектроскопия әлдеқайда тез жүретін әдіс. Дифференциалды спектроскопия Гемоглобинді гемоглобинге қарсы (А), гемоглобин+инозитолгексафосфатқа қарсы (Б) спектрін өлшегендегі байқалатын өзгеріс

Егер зерттелетін заттың нақты анықталған спектрлік қасиеті болса, оның мөлшерін калибрленген график әдісі арқылы анықтау үшін алдын ала оның концентрациясы біртіндеп өсетін ерітінділерінің бір-біріне ұқсас 3-5 параллель қайталамаларын дайындайды (қайталама неғұрлым көп болса – соғұрлым берілген концентрацияға сәйкес нүктенің орташа дәлдігі де жоғары болады). Оны стандарт ерітінді деп атайды. Стандартты ерітіндінің концентрацияларын көрсететін нүктелерінің арасындағы интервалды таңдау үшін мынадай талаптар қойылуы керек: а) ол зерттелетін ерітіндінің концентрацияларының өлшеуге келетін шегін қамту керек, сонымен қатар зерттелетін ерітіндінің оптикалық тығыздығы калибр қисығының орталық нуктелеріне сәйкес келу керек; б) таңдап алынған кюветтің қалыңдығы (l) мен аналитикалық толқын ұзындығында (λ) жарық жұтудың негізгі заңдылығы концентрацияның осы интервалында сақталуға тиіс (көп жағдайда жарық жұтатын қосылыстың толқын ұзындығы λ = λмакс-пен теңдікте болады), яғни А = f(C) теңдеуінің графигі түзу сызық болу керек; в) стандартты ерітінділердің интервалына сәйкес келетін λ-ның мәнінің жұмыс интервалы өлшеулердің әрқашан дәл қайталануын қамтамасыз етуге тиіс.

Қоздырылған молекула сол күйінде ұзақ бола алмайды, ол өзінің әлдеқайда тұрақты алғашқы күйіне өздігінен қайта өтеді. Көптеген молекулалардағы осындай қайта өту процесі энергияны еріткішке немесе ерітіндідегі басқа молекулаларға берілумен аяқталады. Кейбір қоздырылған молекулалар бастапқы күйіне қайта өту үшін энергияның айырмашылығын шығарып жібереді. Флуоресценция деп аталатын бұл процесс төмендегі келесі көрсетілген. Жоғары бағытталған бүтін жебеше (стрелка) фотонды абсорбциялау (жұту) процесін бейнелейді, оның нәтижесінде молекула қоздырылып, алғашқы негізгі G-күйінен біршама жоғарылау S-күйдегі деңгейге көшеді. Қозған молекула, еріткішпен және тыныш молекулалармен соқтығысып, тербеліс энергиясын жоғалтады. Өте тез жүретін қайта өту процесі молекуланы ең төмен тербеліс деңгейіне келтіреді (жебешенің ирек бөлігі). Молекула өз энергиясын жарық түрінде (флуоресценция түрінде, бүтін жебеше) бөліп шығарады (біршама тербелісі бар G-деңгей).

Абсорбциялық коэффициент Толқын ұзындығы Триптофанның абсорбциялық және флуоресценциялық спектрлері

Кәдімгі флуорометрдің схемасы Көпшілік флуоресценттік тәжірибелерде екі түрлі өлшеулер жүргізіледі – флуоресценцияның салыстырмалы интенсивтілігі және квантта шығымын өлшеу.