Рубцова М.Ю., Уляшова М.М., Халилова Ю.И., Егоров А.М. Химический факультет МГУ имени М.В. Ломоносова ЗАО «НПП ИММУНОТЕХ»

Проблема: Устойчивость микроорганизмов к действию бета-лактамных антибиотиков Причина : Продукция бактериальных ферментов – бета-лактамаз

Бета-лактамазы представляют собой группу бактериальных ферментов, способных гидролизовать бета-лактамные антибиотики 1940 – E. Abraham E. Chain описали инактивацию пенициллина в бесклеточном экстракте культуры E. coli 1965 – описана бета-лактамаза ТЕМ-1 Наст. время – описано более 700 бета-лактамаз N O COOH S HN COOH S OH H2OH2O

Классификация семейства бета-лактамаз KPC OXA VIM SPM IMP GIM SIM VIM SPM IMP GIM SIM TEM SHV CTX-M Бета-лактамазы расширенного спектра (БЛРС) Ингибитор-устойчивые бета-лактамазы Карбапенемазы

5 Задача: одновременная идентифицикация нескольких типов бета-лактамаз, определение мутаций в них Возможное решение: использование молекулярно- генетических методов использование мультипараметрических методов исследований

6 Биологические микрочипы Биологические микрочипы – это организованное размещение биологически активных молекул в виде миниатюризированных матриц на специальном носителе Метод ДНК-зондов Микрочип

7 Особенности технологии микрочипов Одновременное определение множества параметров Миниатюризация Автоматизация Высокая производительность Одновременное определение множества параметров Миниатюризация Автоматизация Высокая производительность

Выделение ДНК Амплификация гена (ПЦР) Введение метки Гибридизация Детекция результатов гибридизации по активности метки

Детекция результатов гибридизационного анализа 9 Микрочипы с флуоресцентной детекцией Cy3 Субстрат Окрашенный продукт Бт Фермент Микрочипы с колориметрической детекцией

10 Идентификация типа гена C GA C GU T GC A A U C GA G T C A U T A G C Прямая цепь Обратная цепь

11 Выявление точечных мутаций в генах CCGCTTTTTTGCACAACATGGGGG CCGCTTTTTTGCGCAACATGGGGG CCGCTTTTTTGCCCAACATGGGGG CCGCTTTTTTGCTCAACATGGGGG TEM-1TEM-21 TEM-1TEM GSGHYGT......GSGRYGT... AGCTAGCT Анализ нуклеотидных последовательностей генов

ДНК-микрочип для идентификации генов БЛРС и ингибитор-устойчивых бета-лактамаз Контроль иммобилизации Отр. контроль гибр. Полож. контроль гибр. Идентификация типа гена Мутации в blaTEM Мутации в blaSHV Мутации в blaСТХ-М Носитель: найлон Размер чипа: 8 мм х 14 мм Диаметр точки: ~ 350 µm Количество точек: 246 Количество зондов: 78 Идентификация: 3 типа генов β- лактамаз: TEM, SHV и СТХ-М 25 мутаций в них для определения БЛРС и ингибитор-уст. БЛ

13 TEM-1 + SHV-1 + SHV-12 + CTX-M-15 (устойчивость к пенициллинам и цефалоспоринам I-IV пок- ний) Интенсивность, отн. ед. TEM-1 + SHV-1 (устойчивость к пенициллинам и цефалоспоринам I поколения)

Результаты тестирования штамма K. pneumonia, продуцирующего три β-лактамазы: TEM-1, SHV-1 и СTX-M-9 14 Интенсивность, отн. ед. TEM-1 SHV-1 CTX-M-9

Апробация ДНК-микрочипа на клинических штаммах Enterobacteriaceae (n=100) БЛРC – (n = 10):БЛРС+ (n = 90): 24,6% штаммов продуцировали 2 БЛРС SHV-5-like CTX-M-1-like CTX-M-2-like CTX-M-9-like TEM-1-like + SHV-2-like TEM-1-like + SHV-5-like TEM-1-like + CTX-M-1-like TEM-1-like + CTX-M-9-like SHV-1-like + SHV-5-like SHV-1-like + CTX-M-1-like TEM-1-like + SHV-1-like + SHV-2-like TEM-1-like + SHV-1-like + SHV-5-like TEM-1-like + SHV-1-like + CTX-M-1-like TEM-1-like + SHV-1-like + CTX-M-9-like SHV-2-like + CTX-M-1-like SHV-5-like + CTX-M-9-like TEM-1-like + SHV-2-like + CTX-M-1-like TEM-1-like + SHV-2-like + CTX-M-2-like TEM-1-like + SHV-5-like + CTX-M-1-like TEM-1-like + SHV-5-like + CTX-M-9-like SHV-1-like + SHV-2-like + CTX-M-1-like SHV-1-like + SHV-5-like + CTX-M-1-like SHV-1-like + SHV-5-like + CTX-M-9-like TEM-1-like + SHV-1-like + SHV-2-like + CTX-M-1-like TEM-1-like + SHV-1-like + SHV-2-like + CTX-M-9-like TEM-1-like + SHV-1-like + SHV-5-like + CTX-M-1-like TEM-1-like + SHV-1-like + SHV-5-like + CTX-M-2-like Не обн. ТЕМ-1 SHV-1 (TEM-1+ SHV-1) 20% 10% 50%

ДНК-микрочип для определения генов карбапенемаз Id_IMP Id_VIM Id_OXA IMP-1 VIM-1 OXA-23 IMP-2 VIM-2 OXA-40 IMP-5 VIM-7 OXA-51 IMP-11 Id_SPM OXA-58 IMP-14 Id_SIM Id_KPC Id_GIM Контроль иммобилизации Положительный контроль гибридизации Отрицательный контроль гибридизации Идентификация для металло-β-лактамаз Идентификация OXA-β-лактамаз Идентификация KPC-β-лактамаз Носитель: найлон Размер микрочипа: 11мм×15мм Диаметр одной точки: 350 мкм Количество точек: 132 Идентификация карбапенемаз: VIM, IMP, SPM, GIM, SIM (класс B) OXA ( класс D) KPC (класс A)

Апробация ДНК-микрочипа для определения генов карбапенемаз на клинических штаммах Микроорганизм Число штаммов Типы обнаруженных карбапенемаз OXA-23- like OXA-40- like OXA-51- like OXA-58- like VIM-2- like Acinetobacter baumanii n= Pseudomonas aeruginosa n=

Скрининг клинических образцов на наличие БЛРС, ингибитор-устойчивых бета-лактамаз класса А и карбапенемаз классов A, B, D Интегрированный ДНК-микрочип для идентификации β-лактамаз

Благодарности: Химический факультет МГУ имени М.В. Ломоносова Уляшова М.М. Халилова Ю.И. Григоренко В.Г. Игнатенко О.В. НИИ антимикробной химиотерапии, Смоленская гос. мед. академия Эдельштейн М.В. Институт нейрохирургии им. Н.Н. Бурденко Александрова И.А. Финансовая поддержка: ФЦП "Национальная технологическая база" на годы (Контракт ГП/07/442/НТБ/К)

СПАСИБО ЗА ВНИМАНИЕ !