1© ЗАО «Биоград», 2010г. Дробченко А.Е. ЗАО «Биоград», Санкт-Петербург, Бесприборные тесты для подтверждения ВИЧ-Инфекции

Алгоритм тестирования В соответствии с диагностическим алгоритмом, утвержденным методическим письмом Минздравсоцразвития N 4174-РХ от г. «Обнаружение антител к ВИЧ включает два этапа» «На первом этапе проводится выявление суммарного спектра антител против антигенов ВИЧ с использованием различных тестов» «На втором этапе методом иммунного блоттинга проводится определение антител к отдельным антигенам вируса.» © ЗАО «Биоград», 2010г.

Алгоритм тестирования (СП ) 4.3. Стандартным методом лабораторной диагностики ВИЧ- инфекции служит определение антител/антигенов к ВИЧ с помощью ИФА. Для подтверждения результатов в отношении ВИЧ применяются подтверждающие тесты (иммунный, линейный блот). © ЗАО «Биоград», 2010г.

Алгоритм тестирования (СП ) На первом этапе (скрининговая лаборатория). Если получен положительный результат в ИФА, анализ проводится последовательно еще 2 раза (с той же сывороткой и в той же тест-системе, вторая сыворотка запрашивается только в случае невозможности направления для дальнейшего исследования первой сыворотки). Если получены два положительных результата из трех постановок в ИФА сыворотка считается первично- положительной и направляется в референс-лабораторию (Лаборатория диагностики ВИЧ-инфекции центра по профилактике и борьбе со СПИД) для дальнейшего исследования. © ЗАО «Биоград», 2010г.

Алгоритм тестирования (СП ) На втором этапе (референс-лаборатория). Первично положительная сыворотка повторно исследуется в ИФА во второй тест-системе другого производителя, отличающейся от первой по составу антигенов, антител или формату тестов, выбранной для подтверждения. При получении отрицательного результата сыворотка повторно исследуется в третьей тест-системе другого производителя, отличающейся от первой и второй по составу антигенов, антител или формату тестов. В случае получения отрицательного результата (во второй и третьей тест-системах) выдается заключение об отсутствии антител к ВИЧ. … © ЗАО «Биоград», 2010г.

Алгоритм тестирования (СП ) На втором этапе (референс-лаборатория). … При получении положительного результата (во второй и/или третьей тест-системе) сыворотку необходимо исследовать в иммунном или линейном блоте. Результаты, полученные в подтверждающем тесте, интерпретируются как положительные, неопределенные и отрицательные. … © ЗАО «Биоград», 2010г.

Алгоритм тестирования (СП ) На втором этапе (референс-лаборатория). … Референс-диагностика может проводиться также во ФГУН, на базе которых функционируют федеральный и окружные центры по профилактике и борьбе со СПИД, и в ФГУ Республиканская клиническая инфекционная больница (г. Санкт-Петербург). © ЗАО «Биоград», 2010г.

Алгоритм тестирования (СП ) Положительными (позитивными) считаются пробы, в которых обнаруживаются антитела к 2 из 3 гликопротеинов ВИЧ (env, gag, pol) Отрицательными (негативными) считаются сыворотки, в которых не обнаруживается антитела ни к одному из антигенов (белков) ВИЧ или имеется слабое реагирование с белком р Неопределенными (сомнительными) считаются сыворотки, в которых обнаруживаются антитела к одному гликопротеину ВИЧ и/или каким-либо протеинам ВИЧ. При получении неопределенного результата с белковым профилем включающим, белки сердцевины (gag) р 25, проводится исследование для диагностики ВИЧ-2. © ЗАО «Биоград», 2010г.

Алгоритм тестирования (СП ) При получении отрицательного и сомнительного результата в иммунном или линейном блоте рекомендуется исследовать сыворотку в тест-системе для определения р24 антигена или ДНК/РНК ВИЧ. Если был выявлен антиген р24 или ДНК/РНК ВИЧ, повторное обследование в иммунном или линейном блоте проводится через 2, 4, 6 недель после получения первого неопределенного результата. © ЗАО «Биоград», 2010г.

Алгоритм тестирования (СП ) При получении неопределенного результата проводятся повторные исследования на антитела к ВИЧ иммунном или линейном блоте через 2 недели, 3 и 6 месяцев. Если получены отрицательные результаты в ИФА, то дальнейшее исследование не требуется. Если через 6 месяцев после первого обследования вновь будут получены неопределенные результаты, а у пациента не будут выявлены факторы риска заражения и клинические симптомы ВИЧ-инфекции, результат расценивается как ложноположительный. (При наличии эпидемиологических и клинических показаний серологические исследования проводятся повторно по назначению лечащего врача или эпидемиолога). © ЗАО «Биоград», 2010г.

Подтверждающие тесты В рамках централизованных мероприятий для подтверждения результатов положительных по ВИЧ в ИФА закупались 2 вида подтверждающих тестов: «Лизатный иммуноблот» - Western Blot, спектр антигенов ВИЧ разделенных при помощи электрофореза. Антигены производятся из вирусного лизата. Полный спектр. «Рекомбинантный иммуноблот» - рекомбинантные или синтетические антигены ВИЧ. Антигены производятся отдельно и наносятся дискретно. © ЗАО «Биоград», 2010г.

Western Blot Антигены из вирусного лизата распределяются по молекулярным весам при помощи электрофореза © ЗАО «Биоград», 2010г. ВИЧ Нитроцеллюлозная мембрана Гель Сильные стороны: Полный спектр антигенов Слабые стороны: Высокая стоимость Высокий процент неопределенных результатов Высокие требования к квалификации персонала

Неопределенные результаты ПроизводительНаименованиеТипКол-во неопределенных /отрицательных Процент неопределенных результатов Orgenics LtdImmunoComb II HIV 1&2 CombFirm рекомбинант- ный 4 / ,6% Bio-RadGenetic Systems HIV-1 Western Blot лизатный28 / / ,9% 10,7% Bio-RadNew Lav Blot Iлизатный53 / ,6% Bio-RadPepti-Lav 1-2рекомбинант- ный 4 / ,9% InnoGeneticsInno-LIA HIV I/IIрекомбинант- ный 10 / ,3% OrganonLiaTek HIV IIIрекомбинант- ный 10 / ,8% Chiron (Novartis Diagnostcs) RIBA HIV-1/HIV-2 Strip Immunoblot Assay рекомбинант- ный 22 / ,0% Ora SureOra Sure HIV-1 Western Blot лизатный100 / / ,2% 17,0%

1.Инструкция по применению ImmunoComb II HIV 1&2 CombFirm, стр. 4 2.Инструкция по применению GS HIV-1 Western Blot, стр данные для группы высокого риска, образцы отрицательные по EIA (ИФА) 3.Инструкция по применению GS HIV-1 Western Blot, стр данные для доноров крови, образцы отрицательные по EIA (ИФА) 4.Инструкция по применению New Lav Blot I, стр Инструкция по применению Pepti-Lav 1-2, стр. 9 6.Описание продукции на сайте производителя 7.Validation of a new immunoblot assay (LiaTek HIV III) for confirmation of human immunodeficiency virus infection, Transfusion, 1998 Aug;38(8): Evaluation of Chiron HIV-1/HIV-2 Recombinant Immunoblot Assay, Journal of Clinical Microbiology, Nov. 1996, p. 2650– Инструкция по применению Ora Sure HIV-1 Western Blot, стр. 14 данные для группы низкого риска 10.Инструкция по применению Ora Sure HIV-1 Western Blot, стр. 14 данные для группы высокого риска © ЗАО «Биоград», 2010г.

Наименование Определяемые антитела:Оборудование / подготовка растворов Конъюгат Время анализа к Env ВИЧ 1 к Gag ВИЧ 1 к Pol ВИЧ 1 к Env ВИЧ 2 ImmunoComb ® II HIV 1&2 CombFirm рекомбинантный gp120, gp41 p24p31gp36не требует / не требует (все растворы готовы к применению) Конъюгат с щелочной фосфатазой 1 час Биосервис, "Блот- ВИЧ 1/2 +0" рекомбинантный gp160, gp41 p24/ p17 p51gp110/ gp38 вакуумный насос и шейкер / приготовление растворов Конъюгат с пероксидазой хрена часов Эколаб "ИФА Лайн- Блот ВИЧ-1,2" рекомбинантный gp160, gp41 p24p51gp36вакуумный насос и шейкер / приготовление растворов Конъюгат с пероксидазой хрена часов Bio-Rad NEW LAV BLOT I лизатный спектр gp160, gp120 gp41 спектр p24, p40, p55, p17 спектр p31, p51, p66 -вакуумный насос и шейкер / восстановление из концентрата Конъюгат с щелочной фосфатазой 3 часа © ЗАО «Биоград», 2010г.

Критерии положительного результата Критерии положительного результата (Western Blot): ВОЗ (рекомедованы в письме Минздравсоцразвития N 4174-РХ от г.) два env (gp41, gp160, gp120) CDCлюбые два из: p24, gp41, gp 160/120 Американский Красный Крестпо одной полосе из env, gag и pol CRSS Консорциум по стандартизации ретровирусной серологии gag или pol И env (p24 или p31) И (gp41 или gp120/160) © ЗАО «Биоград», 2010г.

17 ИммуноКомб II ВИЧ 1+2 КомбФирм ImmunoComb ® II HIV 1&2 CombFirm gp36 gp41 gp120 p31 p24 Внутренний контроль Наименование Определяемые антитела: к Env ВИЧ 1 к Gag ВИЧ 1 к Pol ВИЧ 1 к Env ВИЧ 2 ImmunoComb ® II HIV 1&2 CombFirm рекомбинантный gp120, gp 41 p24p31gp36 Время анализа – 1 час Не требует разведения реагентов (все реагенты готовы к применению)

© ЗАО «Биоград», 2010г.18 Тест ИммуноКомб КомбФирм разрешен для подтверждения наличия антител к ВИЧ (приказ МЗ РФ 292 от ). Результаты мультицентровых испытаний (Израиль, Франция, Бельгия, Бразилия, Сенегал) * - включая 15 положительных по ВИЧ-1 группы О Без учета неопределенных: чувствительность 100%, специфичность 100%

Исследование MSF (Врачи без границ) Проводилось в 2006 году в Демократической республике Конго организацией MSF (Врачи без границ) 2864 клинических образца исследовались на 2 экспресс тестах, из 365 образцов, положительных по обоим тестам, 229 потдверждались одновременно на лизатном иммуноблоте (WB) и на ImmunoComb® II HIV 1&2 CombFirm (IC). Из 229 образцов 205 были положительными в WB, а 24 – отрицательными или неопределенными. При разбиении на положительные и отрицательные/неопределенные результаты WB и IC совпадали в 227 из 229 случаев. © ЗАО «Биоград», 2010г.

20 Типовой состав набора ИммуноКомб

© ЗАО «Биоград», 2010г.21 Диагностика ВИЧ ИммуноКомб II HIV 1&2 Bispot – скрининговый ИммуноКомб II HIV 1&2 TriSpot Ag-Ab – АГ-АТ ИммуноКомб II HIV 1&2 CombFirm – подтверждающий

© ЗАО «Биоград», 2010г.22 Диагностика вирусных гепатитов ИммуноКомб II HBsAg 90 ИммуноКомб II Anti-HBs ИммуноКомб II HBc IgM ИммуноКомб II HBc IgG ИммуноКомб II HCV ИммуноКомб II HAV IgM ИммуноКомб II HAV Ab NS3 и NS4 NS5 Коровый антиген ВГС Внутренний контроль

© ЗАО «Биоград», 2010г.23 Технология ИммуноКомб позволяет диагностировать широкий спектр инфекций: ВИЧ, HTLV, Гепатиты А, В, С, Цитомегалию, Токсоплазмоз, Хламидиоз, Краснуху, Хеликобактериоз, тропические инфекции.

© ЗАО «Биоград», 2010г.24 Схема постановки анализа 6. Результат анализа в виде окрашенных точек. Верхняя точка: внутренний контроль. Нижняя точка и (или) средняя точки появляются в случае наличия - инфекции. 1. Для индивидуального тестирования гребешок можно согнуть и отломить необходимое количество зубцов. 2. В ряд А ванночки вносятся образцы (сыворотка, плазма или цельная кровь) и контроли. 3. Гребешок вставляется в ряд А и инкубируется (реакция антиген-антитело). 4. Гребешок перемещается из ряда в ряд ванночки в соответствии с инструкцией (промывки и связывание с конъюгатом). 5. Цветная реакция в ряду F.

© ЗАО «Биоград», 2010г.25 Тесты ИммуноКомб сертифицированы СЕ и широко используются более чем в ста странах мира. Как достоверные, высокочувствительные и специфичные тесты ИммуноКомб отобраны для программ ВОЗ, UNAIDS, Красного Креста, допущены FDA (США) для поставок по специальным программам фонда Клинтона.

26© ЗАО «Биоград», 2010г. ЗАО «Биоград» 18 лет в России Адрес:197101, г. Санкт-Петербург, Петровский пр., д. 14, 19-Н тел./факс:(812) , (многоканальные) Спасибо за внимание