Полимеразная цепная реакция с возможностью детекции продукта в реальном времени (RT-PCR). Секвенирование по Сенгеру

Ключевые методы молекулярной биологии. Полимеразная цепная реакция Велегжанинов И.О.

Полимеразная цепная реакция Метод ферментативной наработки in vitro определённых, сравнительно коротких (до нескольких тысяч пар нуклеотидов), двуцепочечных фрагментов ДНК (Ребриков Д. В. и др., 2009). В основе реакции лежит механизм репликации молекул ДНК ферментом ДНК- полимеразой.

Изобретение ПЦР В 1983 г. химик компании Cetus, Кэри Маллис, оптимизируя метод олигомерной рестрикции для идентификации точечных мутаций в ДНК, придумал как многократно увеличить количество копий определённого участка ДНК. Kary Mullis, Лауреат Нобелевской премии 1993 г. по химии

Кадр анимированной схемы, размещённой по адресу:

Кадр анимированной схемы, размещённой по адресу:

Кадр анимированной схемы, размещённой по адресу:

Кадр анимированной схемы, размещённой по адресу:

Кадр анимированной схемы, размещённой по адресу:

Кадр анимированной схемы, размещённой по адресу:

Кадр анимированной схемы, размещённой по адресу:

Кадр анимированной схемы, размещённой по адресу:

Кадр анимированной схемы, размещённой по адресу:

Кадр анимированной схемы, размещённой по адресу:

Кадр анимированной схемы, размещённой по адресу:

Кадр анимированной схемы, размещённой по адресу:

Состав реакционной смеси Исследуемая ДНК ДНК-зависимая-ДНК-полимераза Дезоксирибонуклеотидтрифосфаты (dNTP) ДНК-затравки (праймеры) Интеркалирующих краситель (обычно SYBR Green) или Флуоресцентно меченные ДНК-зонды Флуоресцентно меченные ДНК-зонды Разрушение водородных связей между цепями ДНК (денатурация) °С °С Гибридизация праймеров на ДНК (отжиг праймеров) °С Синтез комплементарных цепей ДНК (элонгация) Буферный раствор с MgCl °С «Горячий старт» - активация полимеразы, размешивание компонентов 5-15 с 1-10 мин 30 с 0-15 с

«Классический» ПЦР Детекция продукта по окончанию реакции Ornithobacterium rhinotracheale в мясе курицы при различных методах лечения. Взято с

ПЦР «в реальном времени» Циклы Пороговый цикл (С t )

ПЦР «в реальном времени» SYBR Green TaqMan Изображение взято с сайта: quantification.de/chemistry.html Изображение взято с сайта:

ПЦР «в реальном времени» SYBR Green TaqMan Изображение взято с сайта: quantification.de/chemistry.html Изображение взято с сайта:

ПЦР «в реальном времени» SYBR Green TaqMan Изображение взято с сайта: quantification.de/chemistry.html Изображение взято с сайта:

ПЦР «в реальном времени» SYBR Green TaqMan Изображение взято с сайта: quantification.de/chemistry.html Изображение взято с сайта: Относительная простота дизайна праймеров Относительная дешевизна Высокая специфичность детекции Возможность проведения мультиплексного анализа: До 5 целевых генов в одной пробирке! Возможность проведения мультиплексного анализа: До 5 целевых генов в одной пробирке!

Анализ содержания ГМО в продуктах питания Установление отцовства Криминалистика – «Генетические отпечатки пальцев» В медицине – Диагностика наследственных заболеваний – Диагностика инфекционных заболеваний – Контроль эффективности лечения – Персонализированная медицина Прикладное применение ПЦР

Применение в научных исследованиях Анализ экспрессии генов и miRNA Анализ уровня метилирования ДНК Филогенетические исследования Анализ SNP Амплификации ДНК как этап секвенирования Амплификация ДНК для генно- инженерных манипуляций

Применение в научных исследованиях Анализ экспрессии генов и miRNA – Анализ количества мРНК гена (qRT-PCR) – Анализ экспрессии микроРНК – Технология «ПЦР-чип»

Анализ количества мРНК гена (qRT-PCR)

Изучение механизмов реакции организмов на воздействие внешних факторов (радиобиология, факториальная экология, токсикология, и. т. д.)

Нетермический эффект терагерцового излучения на экспрессию генов мышиных стволовых клеток ( Alexandrov et al., 2011)

Анализ количества мРНК гена (qRT-PCR) Изучение механизмов реакции организмов на воздействие внешних факторов (радиобиология, факториальная экология, токсикология, и. т. д.) Изучение механизмов морфогенеза, старения, естественных ритмов и прочих физиологических процессов

Дневные ритмы изменения экспрессии генов Cry 1, Cry 2, Clock и Cycle у мандрепоровых полипов (Hoadley et al., 2011)

Анализ количества мРНК гена (qRT-PCR) Изучение механизмов реакции организмов на воздействие внешних факторов (радиобиология, факториальная экология, токсикология, и. т. д.) Изучение механизмов морфогенеза, старения и естественных ритмов и прочих физиологических процессов Верификация выключения/снижения активности гена в мутантных организмах. Анализ эффективности генетических конструкций сверхактивации определённых генов. Анализ эффективности формакологической модификации активности определённых генов.

Дрозофилы, в нервной ткани которых сверхэкспрессирован ген D-GADD45 имеют увеличенную продолжительность жизни. Наличие сверхэкспрессии было верифицировано с помощью qRT-PCR.

Анализ количества мРНК гена (qRT-PCR) Изучение механизмов реакции организмов на воздействие внешних факторов (радиобиология, факториальная экология, токсикология, и. т. д.) Изучение механизмов морфогенеза, старения и естественных ритмов и прочих физиологических процессов Верификация выключения/снижения активности гена в мутантных организмах. Анализ эффективности генетических конструкций сверхактивации определённых генов. Анализ эффективности формакологической модификации активности определённых генов. Изучение механизмов воздействия биологически активных веществ

Действие 20-гидроксиэкдизона на метаболизм глюкозы в H4IIE клетках (Kizelsztein et al., 2009) …dose-dependent inhibition of Dex-cAMP stimulated expression of phosphoenolpyruvate carboxykinase (PEPCK) (B) and glucose-6-phosphatase (G6Pase) (C) gluconeogenic enzymes… BC

Анализ количества мРНК гена (qRT-PCR) Изучение механизмов реакции организмов на воздействие внешних факторов (радиобиология, факториальная экология, токсикология, и. т. д.) Изучение механизмов морфогенеза, старения и естественных ритмов и прочих физиологических процессов Верификация выключения/снижения активности гена в мутантных организмах. Анализ эффективности генетических конструкций сверхактивации определённых генов. Анализ эффективности формакологической модификации активности определённых генов. Изучение механизмов воздействия биологически активных веществ И МНОГОЕ МНОГОЕ ДРУГОЕ!

Применение в научных исследованиях Анализ экспрессии генов и miRNA – Анализ количества мРНК гена (qRT-PCR) – Анализ экспрессии микроРНК – Технология «ПЦР-чип»

Анализ экспрессии микроРНК Схема из Alberts et al., 2008 Некодирующие РНК размером ~22 оснований В человеческих клетках обнаружено более 400 мкРНК Ими регулируется экспрессия около 1/3 части генов

Схема из руководства к системе miScript miRNA PCR Array (QIAGEN) com/Manual/ pdf

Применение анализа экспрессии микроРНК Эпигенетика Онкология Радиобиология Биология развития ……….

Применение в научных исследованиях Анализ экспрессии генов и miRNA – Анализ количества мРНК гена (qRT-PCR) – Анализ экспрессии микроРНК – Технология «ПЦР-чип»

Технология «ПЦР-чип» Анализ экспрессии 84 генов за один раз Схема организации реакций в ПЦР-чипе фирмы QIGEN, рисунок из руководства к продукту

Технология «ПЦР-чип» Анализ экспрессии 84 видов miRNA за один раз Схема организации реакций в ПЦР-чипе фирмы QIGEN, рисунок из руководства к продукту

Применение в научных исследованиях Анализ экспрессии генов и miRNA Анализ уровня метилирования ДНК Филогенетические исследования Анализ SNP Амплификации ДНК как этап секвенирования Амплификация ДНК для генно- инженерных манипуляций Гиперметилирование промотора гена – это один из вариантов сайленсинга (выключения) активности гена. Метилирование/деметилирование ДНК является одним из механизмов регуляции экспрессии генов в процессе роста и дифференцировки клеток, клеточном старении и ответе на стрессы и другие внешние воздействия. Гиперметилирование опухолевых супрессоров может служить одной из стадий малигнизации клетки

Применение в научных исследованиях Анализ уровня метилирования ДНК – Метил-чувствительная ПЦР – Метил-специфичная ПЦР – Технология «ПЦР-чип» для анализа метилирования промоторов генов – Анализ кривой плавления ДНК, обработанной бисульфитом Na (MS-HRM) – Секвенирование ДНК, обработанной бисульфитом Na Not1 Eag1 SacII HpaII MspI

Анализ уровня метилирования ДНК – Метил-чувствительная ПЦР – Метил-специфичная ПЦР – Технология «ПЦР-чип» для анализа метилирования промоторов генов – Анализ кривой плавления ДНК, обработанной бисульфитом Na (MS-HRM) – Секвенирование ДНК, обработанной бисульфитом Na Применение в научных исследованиях Бисульфитная модификация ДНК

Анализ уровня метилирования ДНК – Метил-чувствительная ПЦР – Метил-специфичная ПЦР – Технология «ПЦР-чип» для анализа метилирования промоторов генов – Анализ кривой плавления ДНК, обработанной бисульфитом Na (MS-HRM) – Секвенирование ДНК, обработанной бисульфитом Na Применение в научных исследованиях

Анализ уровня экспрессии генов, микроРНК, а также уровня метилирования ДНК открывают возможности для исследований в области ЭПИГЕНЕТИКИ, чрезвычайно актуальной, развивающейся молодой науки!!!

Анализ экспрессии генов и miRNA Анализ уровня метилирования ДНК Филогенетические исследования Анализ SNP Амплификации ДНК как этап секвенирования Амплификация ДНК для генно- инженерных манипуляций Применение в научных исследованиях

Филогенетические исследования – Мультилокусные ПЦР RAPD-PCR Inter-SINE-PCR ISSR-PCR – Монолокусный ПЦР Анализ длины микросателлитных повторов Анализ наличия отсутствия SINE повторов Применение в научных исследованиях

Пример использования RAPD-PCR для анализа различных биотипов Табачной белокрылки (Bemisia tabaci) Rabello et al., 2008 Результат ПЦР с двумя произвольными десятичленными праймерами

Филогенетические исследования – Мультилокусные ПЦР RAPD-PCR Inter-SINE-PCR ISSR-PCR – Монолокусный ПЦР Анализ длины микросателлитных повторов Анализ наличия отсутствия SINE повторов Применение в научных исследованиях

Analysis of DNA of Higher Primates Using Inter-SINE PCR (Ryabinina et al., 2008) Fig. 1. Inter-MIR PCR of human and ape DNA samples. Homo sapiens: (1 to 24); Apes: common chimpanzee, Pan troglodytes,(25); gorilla, Gorilla gorilla,(26); Bornean orangutan, Pongo pygmaeus, (27); white-handed gibbon, Hylobates lar, (28); lion-tailed macaque, Macaca silenus, (29); stump-tailed macaque, Macaca arctoides, (30); rhesus monkey, Macaca mulatta, (31); olive baboon, Papio Anubis, (32); hamadryas baboon, Papio hamadryas, (33); and green monkey, Chlorocebus aethiops, (34). Denatured DNA fragments were separated by means of electrophoresis in polyacrylamide gel with urea. The sizes of molecular size markers (DNA of FKh 174, digested with Hin fI) are shown to the right of electrophoregram.

Филогенетические исследования – Мультилокусные ПЦР RAPD-PCR Inter-SINE-PCR ISSR-PCR (inter-microsatellite-PCR) – Монолокусный ПЦР Анализ длины микросателлитных повторов Анализ наличия отсутствия SINE повторов Применение в научных исследованиях

Анализ длины микросателлитных повторов Схема из Alberts et al., 2008

Анализ длины микросателлитных повторов Схема из Alberts et al., 2008

Филогенетические исследования – Мультилокусные ПЦР RAPD-PCR Inter-SINE-PCR ISSR-PCR (inter-microsatellite-PCR) – Монолокусный ПЦР Анализ длины микросателлитных повторов Анализ наличия отсутствия SINE повторов Применение в научных исследованиях

Секвенирование в филогенетических исследованиях Секвенирование митохондриальной ДНК – 12S и 16S мтДНК (вид-отряд) – D-петля (семья-вид) Севкенирование ядерной ДНК – Гены (вид и выше) – Повторы (вид и выше)

Анализ экспрессии генов и miRNA Анализ уровня метилирования ДНК Филогенетические исследования Анализ SNP Амплификации ДНК как этап секвенирования Амплификация ДНК для генно- инженерных манипуляций Применение в научных исследованиях

SNPs (Single Nucleotide Polymorphism) Однонуклеотидные позиции в геномной ДНК, для которых в популяции имеются различные варианты последовательностей (аллели) с частотой редкого аллеля не менее 1% В среднем на 1000 оснований человеческого генома – 1 SNP SNP – это наиболее частая причина существования нескольких аллелей одного гена

Анализ SNP – РТ-ПЦР с аллельспецифичными праймерами – РТ-ПЦР с аллельспецифичными пробами (зондами) – Анализ кривой плавления ДНК- дуплексов SNPs (Single Nucleotide Polymorphism)

Анализ экспрессии генов и miRNA Анализ уровня метилирования ДНК Филогенетические исследования Анализ SNP Амплификации ДНК как этап секвенирования Амплификация ДНК для генно- инженерных манипуляций Применение в научных исследованиях

Постгеномная Эра 26 июня 2000 года было объявлено о расшифровке генома человека На данный момент известны геномы множества организмов Геном человека, других организмов, последовательности отдельных генов находятся в свободном доступе в интернете Коммерческий синтез олигонуклеотидов качественен, быстр и доступен по цене Всё это предоставляет современным исследователям огромное, неизведанное поле для творчества, базовыми инструментами в котором являются ПЦР и секвенирование, в различных модификациях Всё это предоставляет современным исследователям огромное, неизведанное поле для творчества, базовыми инструментами в котором являются ПЦР и секвенирование, в различных модификациях

Контроль качества ПЦР Проверка соответствия праймеров рекомендуемым параметрам, при их дизайне Подбор стабильного референсного гена Контроль качества и количества выделенной нуклеиновой кислоты Контроль эффективности обратной транскрипции Контроль наличия геномной ДНК в РНК-пробе Отрицательный контроль (загрязнение растворов) Контроль параметров E и α Оценка специфичности ПЦР анализом кривой плавления продукта реакции Калибровка инструмента, при необходимости нормализация по ROX

Рекомендуемые параметры праймеров Длина осн. Температура плавления 52-60˚С Содержание GC: 40-60% Вторичные структуры: – Шпильки: ΔG>-2 ккал/моль на 3-конце и ΔG>-3 ккал/моль - внутренние – Гомодимеры: ΔG>-5 ккал/моль – Гетеродимеры: ΔG>-5 ккал/моль Повторы: – не более 4 динуклеотидных повтора – Не более 4 одинаковых нуклеотидов подряд Повторы: Минимум G/C на 3' конце праймеров (не более трех из пяти последних нуклеотидов) Отсутствие кросс-гомологичности к другим последовательностям в геноме объекта (проверяется в системе BLAST).

Контроль качества выделенной РНК Основной критерий – при элеткрофорезе должны быть чётко различимы 18S и 28S субъединицы рибосомальной РНК! 28S 18S

Значительно более точная, воспроизводимая и простая оценка качества и количества РНК возможна с помощью систем капиллярного электрофореза Контроль качества выделенной РНК - Концентрация РНК - Соотношение 28S/18S - Оценка качества по 10-и бальной шкале относительно идеального образца

Контроль эффективности обратной транскрипции Исследуемые образцы РНК Вода Синтетическая РНК Обратная транскрипция ПЦР в реальном времени с праймерами к синтетической РНК Сравнение количества кДНК комплементарной синтетической РНК

Контроль качества ПЦР Проверка соответствия праймеров рекомендуемым параметрам, при их дизайне Подбор стабильного референсного гена Контроль качества и количества выделенной нуклеиновой кислоты Контроль эффективности обратной транскрипции Контроль наличия геномной ДНК в РНК-пробе Отрицательный контроль (загрязнение растворов) Контроль параметров E и α Оценка специфичности ПЦР анализом кривой плавления продукта реакции Калибровка инструмента, при необходимости нормализация по ROX

Различия в коэфициетах α α – это коэфициент пропорциональности между накоплением молекул продукта реакции (N) и увеличением флюоресцентного сигнала (F) F=αN (Ребриков Д. В. и др., 2009)

Переменная и постоянная фоновая флюоресценция (Ребриков Д. В. и др., 2009)

Эффективность реакции (Ребриков Д. В. и др., 2009)

Оценка специфичности ПЦР анализом кривой плавления продукта реакции (Ребриков Д. В. и др., 2009)

СПАСИБО ЗА ВНИМАНИЕ! Картина ручкой «Мух» неизвестного гения из интернета